Nat Commun | 张勇/阮珏团队合作开发低DNA用量、无扩增的PacBio建库技术LILAP
基因组信息在生命科学研究中具有重要价值。随着价格的下降，基于三代长读长的测序组装越来越广泛地应用于基因组学研究（Nat Methods 2022; Nat Rev Gene 2024）；其中，PacBio高保真（High-fidelity, HiFi）测序技术因其高精度的测序质量被认为是三代测序的金标准。然而，其标准建库方法需要大量DNA输入（>1 µg），限制了其在小型昆虫或珍稀样本中的应用（Proc Natl Acad Sci U S A 2021; Nucleic Acids Res 2020）。DNA扩增虽然可以降低样本输入量，但会引入扩增偏好和人工嵌合序列等错误，影响基因组的完整性及变异检测的准确性。因此，低DNA用量、无扩增且操作简单的PacBio建库方法亟待开发。
首先，LILAP利用Tn5转座酶和发卡结构的PacBio测序接头组成二聚体转座复合物，一步实现DNA片段化和测序接头连接（图1）。所有流程在单个试管内进行，最大限度减少了建库过程中的DNA损失，简化了建库流程。与PacBio公司的标准建库和低DNA扩增建库方法不同（Genes 2019; Genome Biol 2021），LILAP无需特殊实验仪器，所有试剂均可在第三方公司购买，建库成本降至每个样品10美元。同时，测序接头内还可添加条形码（barcode），用于多样本混合建库测序（Genome Biol 2010）。
研究人员进一步使用黑腹果蝇ISO1品系对该技术进行评估，结果显示两个单只果蝇的读段测序质量中位数达到36（即碱基错误率低于0.02%）。从头组装的基因组N50数值超过6 MB，质量分数（QV）超过60（即碱基错误率低于10-6），保守单拷贝基因（BUSCO）组装覆盖度大于98%，远超已发表工作中单只果蝇基因组的质量。
此外，研究团队从基因组组装结果中检测到337个新近产生的结构变异，其中9个复杂结构变异为转座子插入引发序列重复或缺失。这些复杂事件涉及两种转座子：DNA转座子hobo（EMBO J 1986）和LTR逆转座子Jockey（Microbiol Spectr 2015）。研究还发现复杂结构变异插入位点附近富集non-B DNA序列（Trends Genet 2023），并提出转座插入后继续发生双链断裂，随后易于出错的DNA修复过程发生。
类似于结构变异，三代长读长测序也使成簇的串联单核苷酸多态性（clustered SNP, cSNP）的检测更为精准。两个单只果蝇总检测到1756个SNP位点，54.9%彼此临近，位于1000 bp窗口内。32.5%的cSNP由转座子贡献，在基因组内可找到供体，表明基因转换贡献了cSNP突变产生（Nature 2023）。进一步的分析结果支持基因转换可在DNA和RNA水平同时发生。
最后，研究人员在全基因组组装结果中发现了内共生微生物Wolbachia pipientis完整基因组，该微生物广泛分布于节肢动物中。研究团队检测了Wolbachia基因组内变异情况，发现了3个新突变，为后续研究共生菌和宿主的互作提供了新的线索。
综上所述，LILAP作为一种三代低DNA输入量的建库方法，在不扩增的前提下将PacBio测序DNA投入量降低至100 ng，适应于解析小型生物及其内共生体基因组。未来，LILAP可应用于更多场景（图2）：DNA用量受限的小型生物多样性探究及较大物种的体细胞变异分析；果蝇个体水平的全基因组关联分析（GWAS）；宿主-共生体的协同进化研究。
张勇研究组聚焦重复序列的突变机制、功能演化及转化研究，在重复基因与转座子两方面有较深的积累（Cell 2024；Nature Ecology & Evolution 2022/2024; Nature Biotechnology 2023）。为精准解析重复序列，研究组近年来致力于测序技术的开发；LILAP与已发表的二、三代高精度测序技术综述（Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2024）为该方向的近期进展。
LILAP研究的第一作者为中科院动物所博士后贾行星、副研究员谭生军、博士生蔡英傲。通讯作者除张勇、阮珏外还包括贾行星与谭生军。郭言言、沈洁宇、张雅琼、马慧静、张青竹、陈金锋、乔格侠等合作者在文章写作、实验和计算分析等方面提供了大力支持。该研究得到了国家重点研发计划（2019YFA0802600)，国家自然科学基金（32325014）和中国科学院基础前沿科学研究计划（ZDBS-LY-SM005）的支持。
https://www.nature.com/articles/s41467-024-49992-6
参考文献：
1. Mao Y, Zhang G. A complete, telomere-to-telomere human genome sequence presents new opportunities for evolutionary genomics. Nat Methods 19, 635-638 (2022).2. Li H, Durbin R. Genome assembly in the telomere-to-telomere era. Nat Rev Genet (2024).3. Hotaling S, Kelley JL, Frandsen PB. Toward a genome sequence for every animal: Where are we now? Proc Natl Acad Sci U S A 118, e2109019118 (2021).4. Adams M, et al. One fly-one genome: chromosome-scale genome assembly of a single outbred Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 48, e75 (2020).5. Kingan SB, et al. A high-quality de novo genome assembly from a single mosquito using PacBio sequencing. Genes 10, 62 (2019).6. Fan X, et al. SMOOTH-seq: single-cell genome sequencing of human cells on a third-generation sequencing platform. Genome Biol 22, 195 (2021).7. Adey A, et al. Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome Biol 11, R119 (2010).8. Streck RD, Macgaffey JE, Beckendorf SK. The structure of hobo transposable elements and their insertion sites. EMBO J 5, 3615-3623 (1986).9. Richardson SR, Doucet AJ, Kopera HC, Moldovan JB, Garcia-Perez JL, Moran JV. The Influence of LINE-1 and SINE Retrotransposons on Mammalian Genomes. Microbiol Spectr 3, MDNA3-0061-2014 (2015).10. Makova KD, Weissensteiner MH. Noncanonical DNA structures are drivers of genome evolution. Trends Genet 39, 109-124 (2023).11. Vollger MR, et al. Increased mutation and gene conversion within human segmental duplications. Nature 617, 325-334 (2023).（上下滑动查看更多）
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