Nat Commun | 刘鹏/王贵强/项光新团队开发多场景、超灵敏气溶胶呼吸道病毒监测系统，实现亚单拷贝空间病毒分辨率
2019冠状病毒病（COVID-19）是由SARS-CoV-2引起的病毒性传染病，可造成严重的呼吸道感染并具有高传播率，目前仍是全球密切关注的重要健康问题。流行病学数据表明，SARS-CoV-2的空气传播在近年来的COVID-19大流行中发挥了重要作用；在过去几年中，SARS-CoV-2已被证实可通过气溶胶在医院、公共交通和学校等不同地点传播，甚至引起所谓的“超级传播事件”。
因此，在人群高度密集的场所部署快速、灵敏的监测设备来监测传染性生物气溶胶已逐渐被视为一种高效、非侵入性的手段，可在不影响正常社会活动的情况下有效遏制疾病的传播。但由于缺乏超灵敏的方法和易于部署的设备，现有气溶胶检测方法检测超低浓度的空气传播病毒仍困难重重。近期，清华大学刘鹏、北京大学第一医院王贵强和温州医科大学项光新团队合作在Nature Communications发表了题为“Multi-scenario surveillance of respiratory viruses in aerosols with sub-single-copy spatial resolution”的文章。研究团队开发了一种集成式微流控盒，能够准确检测SARS-COV-2、甲型、乙型流感和呼吸道合胞病毒，灵敏度为10拷贝/mL；当与高流量气溶胶采样器集成时，该微装置可在400L/min空气流量、30分钟采样时间内，实现0.83拷贝/m³的亚单拷贝空间分辨率，用于空气传播病毒监测。基于此，研究团队设计了一套气溶胶呼吸道病毒监测系统（RIAM），包含多站点采样RIAM（M-RIAMs）、固定实时RIAM（S-RIAM）和漫游实时RIAM（R-RIAM）等不同版本以应用于不同真实环境。经全面评估发现，RIAM系统具有极佳的临床适用性，是气溶胶监测的首选方法。
针对不同的应用场景，RIAM平台提供了三种不同版本的空气传播病毒监测系统，包括用于多站点采样和现场批量分析的M-RIAM，用于在特定位置无需任何人工干预即可连续实时监测空气传播病原体的S-RIAM，以及用于在大型室内环境中对生物气溶胶进行连续采样和分析的R-RIAM。
RIAM内部使用原位PCR的中心生化检测，可提供超高灵敏度的病毒检测。与传统固相核酸提取方法不同，原位PCR利用一张壳聚糖改性的石英滤纸（QF）进行核酸提取，经简单水洗后可直接在滤纸上进行PCR扩增；此外，所有捕获的核酸均可在不损失的情况下用于扩增。接下来，研究团队将该超灵敏检测体系集成到基于针-胶塞/活塞相组合的模块化介观微流控卡盒内，无需手动干预就能实现“样本入-结果出”的自动化核酸检测。综上，这种结合-洗涤-扩增方法不仅为检测气溶胶中的病毒提供了超高灵敏度，而且简化了集成微流控盒的结构。
为操作上述微流体盒，研究团队使用模块化设计结构构建了一个紧凑的控制和检测仪器，由流体驱动模块、PCR热循环模块和四色荧光检测模块组成，可同时处理两个微流控盒。将试剂盒插入仪器后，整个分析过程就可以由仪器自动进行。
研究团队首先测试了QF滤纸在RNA提取和PCR扩增方面的性能；然后为RIAM设计了一个四重PCR系统，能够同时检测四种常见的人类呼吸道病毒，包括SARS-COV-2、甲型、乙型流感和呼吸道合胞病毒（RSV），并制备了四种呼吸道病毒的浓度梯度以确定检测限（LoD）。结果显示，RIAM对SARS-COV-2、甲型流感、乙型流感和RSV分别实现了10、5、5和5拷贝/mL的超低LoD。
接下来，研究团队使用紧凑型仪器测试在试剂盒中进行检测的灵敏度。结果显示，RIAM系统对所有四种呼吸道病毒均具有显著的灵敏度，LoD达到为10拷贝/mL，比商业检测试剂盒提高了一个数量级以上。特别地，RIAM检测SARS-COV-2奥密克戎变异株的LoD为20拷贝/mL，随着引物的进一步优化，该灵敏度可以提高到10拷贝/mL。
为分析气溶胶中的空气传播病毒，研究团队采用空气流速为400L/min的旋风气溶胶采样器来收集气溶胶颗粒，并开发了一种包含多个气溶胶采样器的多站点采样RIAM（M-RIAM），用于在多个地点收集气溶胶，并进行批量分析。当采样缓冲液为1ml（全部用于检测）、采样时间为30分钟时，在理想条件下M-RIAM亚单拷贝空间分辨率可达0.83拷贝/m³，这是迄今报道的最高空间分辨率。
研究团队使用从北京大学第一医院COVID-19病房采集的气溶胶和表面拭子样本对M-RIAM进行了全面评估，发现气溶胶样本分析可有效地反映气溶胶传播的风险。接下来，研究团队在5个病房内收集了210个环境样本进行检测，包括气溶胶样本和表面拭子样本。
结果显示，室内气溶胶样本的阳性率最高（60%），表明气溶胶监测可能是比表面拭子法更灵敏的检测环境病毒的工具。气溶胶样本可以实现空间的全覆盖，不受采样点偏差的影响，从而可以更客观地评估气溶胶暴露引起的感染风险。此外，气溶胶样本的阳性检出率也与患者患病情况直接相关，可准确反映患者疾病状态（就个体病毒脱落而言）。
研究团队还开发了一种固定式实时RIAM（S-RIAM），用于半连续监测特定位置的空气传播病原体，检测结果呈阳性时需要人工干预进行系统清理。S-RIAM由四个模块组成：旋风生物气溶胶采样器、自动采样装置、可储存多达8个采样盒的装载托盘以及控制和检测系统。S-RIAM经改装后可组装在机器人底盘上，形成漫游实时RIAM（R-RIAM），用于在大型室内环境中对生物气溶胶进行连续采样和生物气溶胶分析。
与将气溶胶收集到样品管中的M-RIAM不同，S-RIAM和R-RIAM中的自动采样装置使用蠕动泵通过针头将采样器收集管中的样本液体，定量注入试剂盒样本容器中；样本后装载完毕后，装载托盘可将试剂盒移动到多重PCR检测系统进行病毒检测
研究团队使用全身吸入暴露系统（WIES）评估了S-RIAM监测SARS-COV-2空气传播的能力。结果显示，S-RIAM成功检测到由WIES产生的SARS-COV-2浓度梯度假病毒样本，表明S-RIAM在气溶胶监测中具有可靠性。
为验证S-RIAM在真实环境中监测SARS-CoV-2和其他呼吸道气溶胶病毒的适用性，研究团队在多个实际地点部署了S-RIAM，包括办公场所、集中宿舍和医院中RSV阳性婴儿的儿科病房。结果显示，S-RIAMs能够连续、超灵敏地检测气溶胶中的SARS-CoV-2，具有极佳的临床适用性。
综上所述，研究团队开发了RIAMs，该系统能够对气溶胶中的 SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒进行超灵敏和连续监测；并设计了多个版本包括M-RIAM、S-RIAM和R-RIAM版本，适用于不同的应用场景。与每分钟400 升的大容量气溶胶采样器集成后，RIAMs可达到无与伦比的亚单拷贝空间病毒分辨率（0.83拷贝/m³），成为迄今已知最灵敏的空气传播病毒检测设备。此外，经实验室模拟和真实场景验证，RIAMs具有超灵敏性以及进行连续空气传播病毒监测的可靠性。总之，RIAM作为降低空气传播病毒风险的有效解决方案显示出巨大潜力。
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