【BD“小海胆”最新单细胞文章】人肿瘤浸润MAIT细胞在大肠癌中具有识别细菌抗原的特征

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文章引言

    6月23日，美国西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心在Cell Reports Medicine杂志上发表了基于BD Rhapsody™平台上的单细胞研究又一力作。

（图片来源于文章）

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文章亮点

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BD Rhapsody™单细胞平台

多组学：靶向转录组（Target mRNA  259个基因）＋AbSeq 抗体（48个表面蛋白）

高效：多样本混样检测（BD Single-Cell Multiplexing Kit, SMK）

低成本：靶向转录组测序2K~3K reads/cell, 仅为全转录组方法所需测序深度的十分之一

高灵敏度：检测低活性样本( 临床组织样本)、检测低浓度样本（稀有细胞亚群）

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单细胞多组学实验方案

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样本来源于三个大肠癌病人以及1个健康供体

- 通过流式分选tet-MR1富集肿瘤组织（大肠癌病人）和PBMC（健康供体）中的MAIT细胞

- 使用BD Sample tag （SMK）样本混样抗体分别标记不同的肿瘤组织样本和PBMC样本

- 使用BD AbSeq 48种抗体对混样后的样本进行蛋白标记 

- 将所有样本加入BD Rhapsody™Cartridge(微孔板)， 使用磁珠捕获单细胞。裂解单细胞后，对靶向mRNA、AbSeq蛋白、多样本标签进行cDNA建库及测序

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实验详解——背景

    黏膜相关恒定T(mucosal-associated invariant T, MAIT)细胞是一种在进化上高度保守的T淋巴细胞亚群,具有与先天自然杀伤T细胞相似的天生功能。MAIT细胞识别由MHC-Ib相关蛋白MR1提供的微生物来源的维生素B代谢物，可以检测和裂解微生物感染的细胞，因此被认为在粘膜中起着假定的免疫监视作用。（来源：百度学术）

    MAIT细胞已在多种肿瘤类型中被发现，包括胃、肺、乳腺、肝脏、甲状腺、结肠直肠、肾脏、大脑和多发性骨髓瘤。研究人员们旨在破译MAIT细胞在人类癌症中的作用机制。

    越来越多的证据表明，肠道菌群可以在癌症免疫疗法中强烈影响药物的抗肿瘤功效。早期的研究表明，微生物组免疫疗法通过从肠腔转移细菌产物到次要淋巴器官，显著改善了肿瘤特异性T细胞的作用。从那时起，许多报道表明肠道菌群的组成影响抗癌治疗反应，包括针对CTLA-4和PD-1的免疫检查点抑制疗法。但是，针对其背后不同的应答机制了解甚少。

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实验详解——结果

1.大肠癌患者中肿瘤浸润MAIT细胞表现出不同的蛋白和基因图谱 （具体结论如下图所示）；

Figure 1A 通过流式检测发现，大肠癌患者组织中MAIT细胞占总T细胞的比率高于非小细胞肺癌（NSCLC）和肾癌(RCC)患者组织。Figure 1B 通过流式对比分析了大肠癌患者的肿瘤组织、PBMC和癌旁组织，结果表明MAIT在三者中的比率没有明显差异。Figure 1C UMAP结果分析表明癌旁组织和PBMC中的MAIT表型差异Figure 1D 为了进一步深度解析大肠癌中的MAIT细胞，研究人员们先从肿瘤组织和PBMC中分选了MAIT细胞，然后利用BD Rhapsody™单细胞多组学平台同时从mRNA和蛋白水平进行了分析。从结果图中我们可以看到，相较于PBMC中的MAIT，肿瘤浸润MAIT细胞高表达蛋白CD69, CD103, CD38, CD39, 低表达蛋白CD27 , CD49d；在基因水平上，大多数肿瘤浸润MAIT细胞表达CCL4, CCL3, RGS1，显示对炎症反应的高度应答。Data S1 深度分析基因水平的测序数据，相比于PBMC，肿瘤浸润的MAIT细胞表达更多的凋亡信号和更高的TCR信号传导

2.在肿瘤浸润MAIT细胞中，鉴别出了一种表达CD4+Foxp3+的细胞亚群 （具体结论如下图所示）；

Figure 2A UMAP图显示CD4 + MAIT细胞的独特亚群，其中一些细胞共表达CTLA-4和Foxp3

Figure 2B 通过流式检测其他大肠癌浸润的组织样本，来验证确认这一独特亚群CD4+Foxp3+的肿瘤浸润MAIT （包括figure S2A）

Figure 2C 针对CD4+Foxp3+MAIT细胞，在PBMC样本中没有检测到，在癌旁组织中是少量，在肿瘤组织中，该细胞群占总MAIT细胞的比率为1%-14%

Figure 2D 类似于常规的Treg，Foxp3+MAIT细胞高表达Helios, CTLA-4, CD25，低表达CD127；与Foxp3-MAIT细胞的表达情况相反

Figure 2E CD4+Foxp3+MAIT和CD4 + MAIT的比率存在关联性

Figure 2F 功能试验分析发现CD4+Foxp3+MAIT具有产生促炎症性因子TNF-α的能力

3.在肿瘤浸润MAIT细胞中存在高表达CD39 (具体结论如下图所示)；

Figure 3A 肿瘤浸润MAIT细胞中CD39为高表达，而癌旁组织及PBMC中CD39的表达比率很低

Figure 3B&3C 相较于CD39-的细胞亚群，CD39+MAIT细胞高表达CD103, CD69, KLRG1，以及低表达IL-7R；抑制性受体PD-1 和CTLA-4在CD39+MAIT细胞中表达上调

Figure 3D 相较于CD39-的细胞亚群，CD39+MAIT细胞群高表达Ki-67, 显示出更高的表达率Figure 3E 实验结果表明CD39+MAIT细胞展现了较低的细胞因子生产能力Figure 3F 用大肠杆菌以TCR驱动的方式特异性的刺激MAIT细胞，体外分析结果表明，大肠杆菌刺激后诱导了MAIT细胞表达CD39。当anti-MRI抗体阻止了刺激，CD39的表达明显下调，揭示了外周血MAIT细胞的TCR依赖性诱导反应；大多数CD39+细胞IFNγ阴性表达；尽管细胞因子刺激（IL-18和IL-12）诱导MAIT细胞产生IFNγ，但没有诱导产生CD39

4.TCR依赖性MAIT细胞激活与肿瘤细菌浸润有关(具体结论如下图所示)：

Figure 4A 研究人员们认为结肠组织最容易被细菌浸润，其次是肺和肾脏，有鉴于此，大肠癌患者组织中肿瘤浸润MAIT细胞CD39的表达更高Figure 4B 利用宏基因组序列分类软件Kraken分析了细菌组成，相较于癌旁组织，肿瘤组织中的细菌数量明显增高Figure 4C 进一步深入分析发现，肿瘤组织与癌旁组织相比，含有一些特别丰富的细胞菌群，包括大肠杆菌Figure 4D 与不同的共培养条件相比，活细菌和具核梭杆菌的培养上清液可以活化MAIT细胞， anti-MRI阻断可以显著减少IFNγ产物，认为具核梭杆菌对MAIT细胞的激活是通过介导TCR相关信号

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文章总结

    在该研究中，通过流式检测以及单细胞测序（使用 BD Rhapsody™单细胞多组学平台）全面深度解析大肠癌中的肿瘤浸润MAIT细胞，鉴定出一个表达CD4和Foxp3的肿瘤浸润MAIT细胞亚群，肿瘤浸润MAIT细胞中高表达TCR诱导的CD39。测序数据表明，大肠癌患者肿瘤组织中，细菌的浸润程度很高，并且凸显了一个特别的高表达菌群——具核梭杆菌，具有以TCR依赖性方式激活MAIT细胞的能力。

    综上，本研究提供了大肠癌中MAIT细胞对微生物抗原应答反应的证据，通过操纵MAIT细胞或者微生物的方法，为癌症治疗提供了新的可能途径。

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BD小海胆为您介绍

BD“小海胆”为您介绍——单细胞多组学平台BD Rhapsody™

BD Rhapsody™单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量，提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案，以满足不同的实验需求，其独特的混样技术可有效节约时间与成本。

系统组成包括：

•BD Rhapsody™ 单细胞成像系统

•BD Rhapsody™ 样品上样工作站

•BD Rhapsody™  cartridge (微孔板) 

•分子标签试剂和文库制备 

•全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒 

•AbSeq蛋白检测试剂盒 

•多样本混样检测试剂盒 （SMK）

•VDJ检测试剂盒 

•单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq™

“小海胆”的杀手锏：BD™AbSeq & Sample Tag（SMK）

AbSeq：近500种 抗体（人 & 鼠）可供选择，联合RNA检测，蛋白质和RNA水平同时分析

1.深度解析细胞群，

2.提高细胞分群分辨率

3.帮助发现新的细胞亚型，助力免疫学研究

Sample Tag（SMK）: 最多可同时检测12个样本

1.同时兼容细胞和组织样本

2.通过分析共表达来提高样本质量

3.节约时间和成本

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伯豪生物单细胞多组学研究

伯豪生物作为国内单细胞组学研究整体解决方案的提供者和领导者，伯豪生物已经建立起了完整的单细胞水平的研究平台，贯穿起基因组、转录组、表观组、蛋白组、免疫组等多组学交叉领域，也整合了包括SMART-Seq在内的多种经典单细胞测序技术和包括BD Rhapsody™、10X Genomics在内的创新单细胞分析技术，涵盖单细胞基因组测序、单细胞转录组测序、单细胞ATAC测序、单细胞转录组和蛋白质标志物平行分析等等。

所以，赶紧来Pick 我吧， 伯豪生物携手“小海胆”带你 “乘风破浪”，喝着“mojito”, 一起遨游在知识海洋里, 开拓领域新发现~

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