【杂志名称】Cell Stem Cell（IF=21.46）
【发表单位】美国波士顿儿童医院，哈佛医学院，波士顿大学，加州大学等
【发表时间】2020-09-04
【主要技术】10XGenomics
概述：KRAS突变是上皮癌的常见驱动因素。然而，尚不清楚在上皮细胞中致癌性KRAS激活后早期发生的分子变化。研究人员比较了四组样本中KRAS激活后单细胞分辨率下的转录变化。除了患者样品和基因工程小鼠模型外，研究人员还从原代小鼠和人诱导的多能干细胞衍生的肺上皮细胞开发了类器官系统，从而对早期肺腺癌进行建模。在所有四种情况下，表达致癌性KRAS的肺泡上皮祖细胞（AT2）均降低成熟谱系基因的表达。这些发现证明了体外类器官方法可用于揭示致癌性KRAS表达的早期结果。该文献提供大量数据集，并描述了能够区别早期肺癌中转录差异的类器官工具，从而有助于寻找KRAS驱动的肿瘤靶标。实验样本
一、远端肺上皮的scRNA-Seq揭示早期肿瘤形成过程中KRASG12D激活细胞的特异Cluster图1 利用scRNA-seq分析体内LUAD早期上皮细胞群用Ad5-CMV-Cre感染KY小鼠，7周后，用FACS收集重组[YFP+]和未重组[YFP-]细胞。然后用10XGenomics scRNA-seq来检测肺腺癌(LUAD)早期的基因表达。从图看供分成4个亚群，C1亚群主要由YFP +细胞组成，C0亚群是有YFP-细胞组成，而C2和C3中同时存在YFP +和YFP-细胞。AT2细胞的marker基因Sftpc和Lyz2在C0和C1中表达最高，纤毛细胞的marker基因Foxj1和Cd24在C2中表达最高，棒状细胞的marker基因Scgb1a1 和Scgb3a2在C3中表达最高。AT2细胞先前被认为是肺腺癌细胞的起源，并且是唯一种在KRASG12D表达上形成转录上不同簇的肺上皮细胞类型。因此，研究者集中研究了KRAS激活对AT2细胞的影响。对C0和C1两个亚群的基因、转录因子(TF)和辅助因子(TFC)进行差异表达(DE)分析。原癌基因Myc和Id1（一种可促进非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和转移的TF）在C1中高表达。转录因子(TF) Nkx2-1和AT2细胞特征转录因子 Etw5在C0中高表达。此外，与配对的癌旁组织相比，NSCLC肿瘤组织中发现TF Foxq1高表达，肺发育过程中表达的TF Etv4以及Klf4对诱导细胞的多能性很重要，且在C1中高表达。因此，当KRASG12D表达时，AT2细胞下调TF/TFCs维持AT2细胞特征，而已知促进肿瘤生长、对发育过程重要并诱导多能性的因子表达增加。小鼠AT2细胞Marker基因表达在C1中明显低于C0。有报道显示原代人LUAD包含表达多种谱系特异性特征的细胞。本研发现C1的AT2细胞markers Sftpc，Lyz2和Etv5的表达较低，这与AT2细胞特征的丢失一致。值得注意的是，肺泡1型（AT1）markers Aqp5和Pdpn以及棒状细胞 markers Scgb1a1和Scgb3a2被上调，表明其他肺上皮细胞类型的转录启动作用。此外，小鼠肺干细胞的markers Ly6a(SCA1)和KrasLSL-G12D/+；p53fl/fl(KP)肺癌模型中的肿瘤增殖细胞也在一些C1细胞中上调。二、体外类器官可迅速再现体内肿瘤进展
为了更好地了解KRASG12D激活后的转录程序，研究者开发了一种体外类器官系统，使他们能够在致癌的KRAS诱导后不久快速模拟原代肺AT2细胞的变化。通过解剖成年KY鼠、KrasLSLG12D/+，p53fl/fl，Rosa26LSL-YFP-KPY鼠和Rosa26LSL-YFP(Y)对照小鼠的肺脏制备类器官,并用FASC分离AT2细胞。在体外用Cre病毒感染细胞，并在ALI共培养系统中与基质细胞培养。在Cre表达时，几乎所有的有机物都是YFP+，这表明Cre的诱导效率很高。图2 scRNA-seq发现表达KRASG12D的类器官细胞的转录特征
为了进一步表征KY-CRE类器官，研究者对如前所述的来自KY-CRE和KY-Emp类器官的第7天EPCAM +细胞进行了scRNA-seq。数据确定了3个亚群：C0org，C 1org和C2org。C1org主要由KY-Emp细胞组成，代表对照簇，而C0org和 C2org主要包含KY-CRE细胞。相关分析显示，所有三个亚群是不同的，且C0org和C1org呈负相关。与对照亚群C1org相比，C0org和C2org中的KRAS激活的基因集上调（E图）。与C1org相比，C2org中的NF-kB激活基因集表达较低（F图），而C0org中的则较高，这表明只有一个Cre簇具有上调的NF-kB信号传导（F图）。增殖功能基因集仅在C2org中升高，而在C0org中没有升高，这表明尽管两个亚群中的Kras激活基因基因集表达很高，但Cre簇中只有一个具有比对照更高的增殖功能基因集（G图）。接下来进行DE分析，然后识别TF / TFC。与GEMM数据相似，对照C1org的Etv5表达升高，提供了AT2细胞转录特性丢失的其他证据。与对照相比，在两个Cre簇中高表达的TF是Foxq1，而C2org具有Id1的高表达，GEMM中也检测到了两个TF。有趣的是，C0org在肺发育过程中高表达TFSox9。在同一亚群中，分别指示Tgfb和p53信号的Smad7和Trp53也被上调。两个KY-CRE亚群C0org和C2org中AT2细胞的信号减少，类似于GEMM数据。与此一致的是，AT2细胞标记Lyz2和Sftpc以及肺部特征的TF Nkx2-1的表达降低（I）。相比之下，两个KY-CRE簇中的肺发育基因Hmga2和Sox9均被上调（I和J）。此外，还发现Sox9靶基因集在C0org中上调，表明Sox9在这个亚群中高度表达和活跃(K）。接下来，研究者想验证在GEMM中的YFP+亚群中是否也上调了Sox9。令人惊讶的是，与YFP-C0集群相比，YFP+C1亚群中的Sox9和Sox9目标激活相关基因显著上调。值得注意的是，与类器官数据相比，GEMM模型中的变化要细微得多，表达水平也更低。为了确定两个KY-CRE簇是否代表癌细胞发展的两个不同阶段，以及是否从一个簇过渡到另一个簇。研究者用RNA velocity分析了类器官和GEMM scRNA-seq数据集。在类器官数据中，RNA velocity表明表达KRASG12D的AT2细胞从Sox9LOW过渡到Sox9HIGH细胞（图L）。相比之下，尽管C1 GEMM亚群显示出明确的过渡方向，但它并不仅仅针对Sox9 +细胞。观察到的差异可能是由于GEMM中Sox9的表达水平明显降低。总体而言，研究结果发现GEMM与体外诱导的肿瘤类器官系统之间存在许多相似之处。最值得注意的是，两个模型中的AT2细胞谱系基因均被下调，而发育和祖细胞基因均被上调，这提供了在LUAD早期发生分化损失的证据。三、人iAT2s下调KRASG12D表达的分化和上调祖细胞的标记
图3 人iAT2s下调KRASG12d表达的分化和上调祖细胞的标记
为了验证KRASG12D诱导后早期AT2分化标志物的丢失是否也可以在人类细胞中观察到，研究者又设计了一个IPSC系，允许多西环素(Dox)调节iPSC衍生的AT2(IAT2)细胞中KRASG12D的激活。利用IPSC系BU3 NKX2-1-GFP；SFTPC-tdTomato(NGST)，其中包括分别针对内源性NKX2-1和SFTPC基因座的GFP和tdTomato报告基因，将KrasG12D盒与Dox诱导启动子一起整合到AAVS1基因座中（图A）。接下来将iPSCs分化为NKX2-1 +肺上皮祖细胞，通过FACS筛选NKX2-1GFP +细胞，并使用肺定向分化方案生成远端肺泡球（图B）。为了更好地了解SFTPC的丢失，作者进行了scRNA-seq（图B）。使用10X Chromium平台，分析了775个DMSO和1,322个经过dox处理的细胞的转录组，并进行了DE分析。所有细胞的无偏分析显示了3个细胞簇，对照iAT2细胞归为一个簇。DE分析显示在两个经dox处理的群集中KRAS均显着上调，其中之一也显示了增殖标志物（例如MKI67，TOP2A和CDK1）的显着上调（图F）。相反，在对照簇中多个AT2细胞基因被显着上调（例如，LPCAT1，SFTPB，SFTPC，CRLF1，CTSH，SLC34A2，NAPSA和PGC）。与这一观察结果一致，先前发表的iAT2细胞分化(SFTPB、SFTPC、SFTPD、CLDN18、LAMP3、SLC34A2、IL8和NAPSA)和成熟(SFTPA1、SFTPA2、PGC、CXCL5和SLPI)基因集和来自Panglao数据库的20个小鼠与人共享的AT2细胞标记在DOX处理的iAT2细胞(图G)中显著下调，作者在GEMM和小鼠器官数据中也发现了TF ETV5。此外，TFs FOXQ1和ID1以及发育和祖基因SOX9和ETV4均被上调，这也与我们的鼠类数据一致（图H）。经dox处理的iAT2细胞中另一个显着上调的转录物是TM4SF1，最近报道为AT2标记，在体内再生过程中富含Wnt反应细胞（图H）。人iAT2细胞结果表明KRASG12D导致iAT2分化和成熟标志物的下调以及祖细胞和发育标志物的上调，从而证实了GEMM和鼠类器官模型的结果。为了评估在GEMM、小鼠类器官和人iAT2细胞模型中观察到的AT2细胞特性的丧失是否也发生在肺癌患者中，作者对激活了KRAS突变的LUAD样本和来自两期IA LUAD患者的癌旁组织(距离肿瘤>2厘米)进行了scRNA-seq (图A)。非监督聚类确定了上皮(EpCAM+)、成纤维细胞(COL1A1+)和内皮(PECAM1+)细胞亚群(图B、E)。上皮细胞进一步分为AT1(PDPN+)、Club(SCGB1A1+)、纤毛(FOXJ1+)和两个不同的AT2细胞簇，一个由正常肺组织的AT2细胞组成，另一个由LUAD的AT2细胞组成(图C-E)。来自正常肺的AT2细胞以SFTPB和SFTPD高表达为特征，而来自1A LUAD阶段的AT2细胞具有SFTPD低表达（图E）。有趣的是，AT2细胞是唯一在LUAD和正常肺组织中形成不同簇的上皮细胞类型，而其他细胞类型却聚集在一起（图B和C），这与我们在KRASG12DGEMM中的观察结果一致。接下来，作者检查了来自Panglao数据库的小鼠和人类之间共有的20种AT2细胞标记在LUAD患者的AT2细胞中的表达。所有20种标记物均在正常肺和LUAD AT2细胞中高表达，但在其他细胞类型中均未高表达，从而证实AT2细胞亚群注释在正常肺和LUAD中是合适的（图F）。但是，与正常肺的AT2细胞相比，IA LUAD阶段的AT2细胞表达的这些标志物水平降低，这与作者在GEMM，鼠类器官和人类iAT2细胞模型系统中的发现一致（图F）。作者认为这是人类早期LUAD患者样品中AT2细胞特征丢失的第一篇文献。图4 GEMM，鼠和人类器官模型以及早期LUAD患者数据集的比较为了进一步比较四个scRNAseq数据集，作者使用DE分析获得的基因集和先前发布的基因集，计算了鼠类KrasG12D类器官数据集中每个细胞的Z-score。如预期的那样，来自GEMM的对照AT2细胞与对照鼠类器官AT2细胞相关。类器官控制AT2群C1与GEMM模型中的AT2细胞YFP+群marker基因最为相似（图G）。此外，具有致癌性KRAS的鼠类类器官细胞和具有致癌性KRAS的GEMM细胞在转录上是相似的。鼠类器官C0和C2与AT2细胞的YFP + GEMM相关。人类KRAS iAT2和KRAS突变患者数据集与鼠类KRASG12D细胞marker基因相似，其中iAT2和患者细胞与C0最相似。此外，作者从一份使用KrasG12DGEMM的报告（Neidler等人，2019）中发现，研究者的鼠类器官与肺癌进展（“ LUAD进展”）的基因表达特征相关。类器官的数据集还与HALLMARK_ WNT基因集，证明了研究者开发的类器官可代替GEMM，因为已显示Wnt途径在肺癌进展中起重要作用。