单细胞测序加速药物研发|疫苗开发
病毒疫苗
案例1：谢晓亮教授团队利用高通量单细胞RNA和VDJ测序平台，从60位康复期病人身上筛选出8558种病毒蛋白结合抗体序列，成功找出14株高活性的中和抗体。其中编号为BD-368-2的抗体表现突出，在假病毒实验中的半抑制浓度（IC50）达到1.2ng/mL（8pM）；在军事医学研究院P3实验室进行的真病毒实验中，IC50达到15 ng/mL（100pM）。中和抗体体内抗病毒实验进一步证实，利用hACE2转基因小鼠模型，感染SARS-Cov-2后给予BD-368-2的治疗使病毒载量下降~2400倍。而注射BD-368-2后可完全抑制小鼠的病毒感染，达到预防效果。研究团队还利用冷冻电镜得到新冠病毒Spike三聚体与中和抗体的高分辨率3.8Å三维结构密度图。数据显示，抗原上的中和抗体表位与ACE2的结合位点重合，从而揭示出中和作用的结构基础。此外，研究人员还证明了可以根据CDR3H结构的相似性来选择SARS-CoV-2中和抗体[1]。
图 利用高通量单细胞RNA和VDJ测序筛选中和抗体[1]
案例2：范德比尔特大学的研究组在Cell杂志上发表文章[2]，提出了一种名为LIBRA-seq的新的测序技术。作者构建了一个特殊的抗原库，将抗原连接上DNA条码和用于流式细胞术分选的荧光标签。接下来，将这个库与富含B细胞的样本共孵育。最后，将连有荧光标签的抗原和与之结合的B细胞共同分选出来，并进行测序，从而得到BCR-抗原序列图谱。利用LIBRA-seq，研究人员绘制了来自两名HIV感染者的数千个B细胞的抗原特异性图谱，许多HIV和流感特异性抗体的预测特异性得到证实。这项技术可以有效地绘制BCR序列及其对应的特异性抗原图谱，在抗体研发和疫苗制备领域具有广泛的应用。
图 LIBRA-seq及功能验证流程[2]
肿瘤个性化疫苗
NeoVax是一种新抗原（Neoantigen）肿瘤疫苗，主要以新抗原为靶点。新抗原通常是肿瘤细胞在发生发展过程中，随机突变产生的新的蛋白质或多肽，一般特异性表达于肿瘤细胞中但不存在与正常组织细胞中。因此，新抗原也成为了肿瘤免疫治疗的理想靶点。早在2017年，美国Dana Farber癌症研究所应用NeoVax治疗恶性黑色素瘤患者，并取得的良好疗效。6名高复发风险的患者在术后18周开始接受NeoVax疫苗治疗。在接种后的2年多时间内，4名患者未发现肿瘤复发；另外2名恶性黑色素瘤伴肺转移的患者，在接种疫苗后复发，随即开始接受 PD-1 单抗药物的治疗，最终也获得完全缓解并处于无疾病进展状态[3]。为了进一步探究 NeoVax 肿瘤疫苗的远期临床疗效及其机制，研究人员对上述 6 名患者及新入组的2名患者进行长期随访。在术后4年多（55个月）的中位数随访中，8名患者全部存活，其中3名患者仍未出现复发。复发的5名患者中，2名IV期患者接受pembrolizumab（PD-1单抗）治疗后完全缓解（2017年已报道），1名患者接受了手术切除且仍未发现疾病证据（NED），2名患者发展为不可切除的转移性疾病。
图 利用高通量单细胞RNA和VDJ测序筛选中和抗体[4]
对于如此令人兴奋的长期临床疗效，研究人员期望揭示患者体内的变化和机制。研究人员首先试图确定NeoVax疫苗诱导的特异性T、细胞在外周血中的功能状态是如何演变的。他们对新抗原特异性T细胞，尤其是CD4+T细胞的特征进行了跟踪和分析。结果发现，NeoVax 疫苗诱导的新抗原特异性CD4+T细胞表现出记忆性和细胞毒性特征。进一步分析了这些患者的T细胞，发现这些患者体内不仅产生了靶向最初的目标新抗原的特异性T细胞，而且还扩展到识别其他与黑色素瘤相关的新抗原，起到了更强更持久的抗肿瘤效果[4]。
图 CD8T细胞细分及功能富集[4]
[1]. Yunlong Cao, Bin Su, Xianghua Guo, et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells[J]. Cell, 2020, 182(1):73-84.
[2]. Setliff I, Shiakolas A R, Pilewski K A, et al. High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity[J]. Cell, 2019, 179(7):1636-1646.
[3]. Ott PA, Hu Z, Keskin DB, et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[J]. Nature, 2017, 547(7662):217-221.
[4]. Zhuting Hu, Donna E Leet, Rosa L Allesøe, et al. Personal neoantigen vaccines induce persistent memory T cell responses and epitope spreading in patients with melanoma[J]. Nature Medicine, 2021, 27(3):515-525.
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