文献解读|sn-RNA-seq 研究小鼠脊髓神经元类型的多样性
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题目：Single nucleus RNA-sequencing definesunexpected diversity of cholinergic neuron types inthe adult mouse spinal cord
影响因子：12.121
在脊椎动物中，运动控制依赖于脊髓中的胆碱能神经元，这在过去的几百年中已经被广泛研究，但这些神经元的完全异质性及其在成人中的不同功能作用仍有待确定。作者通过单核RNA测序方法来识别并研究一系列胆碱能中间神经元、内脏和骨骼运动神经元。该研究的数据揭示了区分这些类别的胆碱能神经元及其丰富的多样性的标记物。骨骼运动神经元研究的复杂性也反映在我们对界限模糊的神经元类型如何归类至α型、γ型、type3这三个亚型的分析过程中。总之，作者的数据提供了对这一重要的神经元群体的转录组学描述，这些神经元控制着生理和运动的许多方面，并包括衰弱退行性疾病的细胞底物。
技术：单细胞核RNA测序（sn-RNA-seq）；
平台：10x；
样本：小鼠脊髓（12只，4组，每组3重复）；
单细胞核悬液制备方法：以文献（PMID：29466745）方法为基础进行优化，详见原文。（伯豪生物针对单细胞抽核实验现有一款商业化试剂盒在售，若有需求可咨询驻地销售或拨打上海伯豪生物客户服务热线：021-58955370）
图1脊髓胆碱能神经元单核RNA测序整体流程
（1）动物模型解剖取材
（2）抽核
（3）FACS分选（GFP+/DRAQ5+）细胞核
（4）单细胞核捕获及文库构建
（5）测序及数据分析
作者使用一种遗传策略（CAG-Sun1/ sfGFP mice (B6; 129- Gt(ROSA) 26Sortm5 (CAG-Sun1/ sfGFP) Nat/J）来永久标记成年小鼠脊髓中的胆碱能神经元细胞核，并选择性地（GFP+/DRAQ5+）富集它们用于单核RNA测序(snRNA-seq)。这种方法极大程度的降低了背景信号，使我们能够系统地且精准的研究胆碱能神经元的多样性。
本研究结果揭示了一系列胆碱能的神经元间亚型，及骨骼Skeletal motor neurons，MNs之间显著的分子多样性。本研究的数据可在www.spinalcordatlas.org上获得，该网站提供了脊髓胆碱能神经元类型的详细视图，用于识别了每个类型的分子标记，并提供了对其正常生理功能的见解。
来自于16042个细胞核21种胆碱能神经元的u-MAP聚类展示及对应的特征基因展示，揭示了胆碱能神经元的广泛多样性。
图2胆碱能神经元的分类揭示了运动神经元和中间神经元的广泛多样性
图3区分（α，γ，type3）3种运动神经元的新标记分子
图4 α运动神经元细分聚类
图5脊髓胆碱能中间神经元异质性
图6内脏运动神经元的基因表达谱和解剖定位表现出广泛的多样性
综合文章给出的数据结果来看，作者首先对单细胞核数据进行降维聚类(本研究一致采用u-MAP算法)，根据聚类结果，作者先将所有的类群归结成三大类：胆碱能神经元、兴奋神经元、中间神经元；随后作者用一张整体的细分聚类展示了细分亚群的命名编号及对应的分子特征(小提琴图、u-MAP特征基因表达热图、特征基因表达的气泡图)；接下来作者例举了α运动神经元、及脊髓胆碱能神经元的细分。并在最后用实验验证了内脏运动神经元的广泛的多样性。
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