发育生物学|单细胞RNA测序揭示多能干细胞来源的内皮细胞分化轨迹

标题：通过单细胞RNA测序技术揭示多能干细胞来源的内皮细胞分化的转录动力学

时间：2020年3月

技术：单细胞RNA测序（scRNA-Seq）；

平台：10X；

样本：人内皮细胞

目的：多能干细胞来源的内皮细胞产物有潜力治疗缺血性血管疾病。然而，促使诱导多能干细胞向内皮细胞分化并具有细胞特异性的因素尚不清楚。这项研究的目的是使用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）绘制人类胚胎干细胞来源的内皮细胞（hESC-EC）分化的转录图谱和人胚胎干细胞来源的内皮细胞定向分化的细胞动力学图谱，并将这些细胞与成熟的来自不同血管床的内皮细胞进行比较。

方法和结果：使用高效的定向8天分化方案来培养hESC衍生的内皮细胞产物（hESC-ECP），其中66％的细胞共表达CD31和CD144。作者分别在第0天和第4天观察到大量同质的hESC和中胚层细胞群体，随后迅速出现了细胞间明显存在差异的内皮和间充质群体。在分化过程中，拟时序轨迹确定了内皮细胞发生和成熟的转录特征。使用另一hESC系RC11细胞和另一种hESC-EC分化方案，通过scRNA-seq分析证明了转录标记的一致性。实验中总计对105 727个细胞进行了scRNA-seq分析。全局转录比较显示，hESC-EC的转录结构不同于新鲜分离的和培养的人内皮细胞以及器官特异性内皮细胞。

结论：发现内皮细胞和间充质细胞谱系的转录分化，并确定了能够证明内皮细胞发生和成熟的新转录特征。hESC-ECP的转录结构不同于成人和胎儿的EC。

文章思路

1、内皮细胞和间充质细胞谱系转录分化的发现

图1 人胚胎干细胞来源的内皮细胞产物在不同时间点分化的单细胞RNA测序分析

实验人员首先对人胚胎干细胞（H9）进行培养，通过中胚层阶段形成人胚胎干细胞来源的内皮细胞（hESC-EC）产物（图1A）。经过数天的培养，细胞内不同标志物的基因表达高低情况呈现出一定的异变，在将这些细胞聚类后，基因表达的不同揭示了不同类别细胞的命运方向（图1C）。为进一步了解细胞后续的分化情况，研究人员重复培养过程并对第8，12天的样品进行测序（图1C，D），结果表明在D8-E类细胞中差异表达的基因在来自第12天的hESC-EC中展现出了表达的上调。此外GO term富集分析揭示了细胞外基质是一个重要的term（F）。

图2 对所有时间节点样品的单细胞RNA测序分析描绘出了转录组变化并预测了经历hESC-EC产物分化的细胞未来的分化方向

在样品细胞被培养至第4天时，它们经历了从胚胎干细胞到中胚层细胞的分化，继而在第6和8天表现出了内皮细胞和间充质干细胞两个分支（图2A）。实验人员对这些来自不同天数的样品进行细胞标志物表达情况打分以追踪转录动力学，和预想结果一致，所有来自d0的细胞都有着多能性标记。大多数d4细胞有着中胚层细胞标记。D6和d8中的两类细胞则分别表现出了更高的内皮细胞和间充质干细胞标记分数（图2B,C）。RNA速率可用于预测细胞未来的转录状态，没有箭头标示的细胞正处于平衡状态，与间充质干细胞和内皮细胞相关的箭头则指明了它们的成熟期位于何处（图2E）。为了避免H9细胞带来的限制性，实验人员也对RC11细胞系进行了相同的培养与单细胞测序，结果展现出了相同的细胞分群（图2F）。

图3 人胚胎干细胞来源的内皮细胞产物分化拟时序分析

接下来用拟时序分析细胞分化过程与路径信息。H9 hESC-ECP细胞分化路径中出现了连接到内皮细胞和间充质干细胞分支的分叉点（图3A），这与图2A中展现出的分支一致。RC11细胞系也同H9表现出了相同的分叉点。内皮细胞与间充质干细胞分别由它们各自表达上调的标志物和转录因子所界定（图3A,C,D）。RC11细胞系也表现出高度相似的情景。

2、内皮细胞发生和成熟的新转录特征

图4 对另一种人胚胎干细胞来源的内皮细胞分化方案单细胞RNA测序的分析

研究人员进一步分析了不同分化路径转录因子表达的特征，最终选出了144个在拟时序上有着显著表达差异的转录因子，这些差异在RC11与H9细胞分化中均有体现。这些基因中，ERG,EST,SOX7和ELF1已知和内皮细胞分化有关联，这些基因均位于Cluster5中（图5A）。此外，几种没有被明确报导和内皮细胞分化有关的转录因子也遵循着相似的表达图谱。

图5 在人胚胎干细胞来源的内皮细胞分化过程中的转录因子表达的拟时序分析

研究人员进一步分析了不同分化路径转录因子表达的特征，最终选出了144个在拟时序上有着显著表达差异的转录因子，这些差异在RC11与H9细胞分化中均有体现。这些基因中，ERG,EST,SOX7和ELF1已知和内皮细胞分化有关联，这些基因均位于Cluster5中（图5A）。此外，几种没有被明确报导和内皮细胞分化有关的转录因子也遵循着相似的表达图谱。

3、hESC-ECP的转录特征不同于成人和胎儿的EC

图6 人胚胎干细胞来源的内皮细胞和成熟内皮细胞的转录组对比

最后实验人员对hESC-EC的成熟程度进行评估，他们对胎儿内皮细胞，成熟内皮细胞和H9来源的细胞的单细胞RNA测序数据进行对比。PCA的结果表明d6,8,12的hESC-EC和动、静脉血管，淋巴管的成熟上皮细胞相互分离（图6A）。有趣的是d12类细胞和相应的d6,8类发生分离，也不和任一上皮细胞明显地靠近。很大比例的基因只表达在hESC-EC中（图6B）。无论是d8还是d12 hESC-EC细胞都没有表现出对器官特异性标记的正分数（图6C,D），说明它们有着不明确的性质。此外，d6,8,12细胞转录组之间的相关性要比它们和婴儿或成熟内皮细胞的相关性更高（图6E）。

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