发育生物学|单细胞测序揭示肌肉骨骼干细胞分化图谱

shbio 伯豪生物 2022-08-30

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题目：Atlas of Musculoskeletal Stem Cells with the Soft and Hard Tissue Differentiation Architecture

中文题目：单细胞测序揭示具有软硬组织分化结构的肌肉骨骼干细胞图谱

期刊：Advanced Science（IF=16.806）

发表时间：2020年10月

发表单位：浙江大学欧阳宏伟教授和陈晓教授团队

肌肉骨骼系统是人体的重要组成部分，对我们日常生活有重要影响，然而我们对肌肉骨骼的发生发育机制仍缺乏明确认知。2020年10月，浙江大学欧阳宏伟教授和陈晓教授团队在Advanced Science发表的文章“Atlas of Musculoskeletal Stem Cells with the Soft and Hard Tissue Differentiation Architecture”，通过对不同发育阶段的小鼠肢体进行单细胞RNA测序，确定了不同发育阶段的细胞组成；结合拟时序分析，构建了小鼠肌肉骨骼干细胞的发育分化轨迹，并通过体内遗传谱系追踪技术得到证实。此外，Scx敲除小鼠肢体组织的单细胞分析表明，Scx调节MSSC的自我更新和增殖潜力。多组织 RNA测序证明包括肌肉、骨骼、半月板和软骨在内的肌肉骨骼系统组织都在 Scx 基因敲除小鼠中异常发育。这项研究揭示了肢体发育和再生中肌肉骨骼组织形态发生的复杂分子机制和细胞分化轨迹，为我们详细了解肌肉骨骼的发生发育机制奠定了重要基础。

主要结果

1. 小鼠肢体不同发育阶段的细胞组成

为确定肢体的细胞组成，研究者选取不同发育阶段的小鼠后肢（E10.5、E12.5 和 E15.5）进行了单细胞转录组测序，共获得1533个单细胞，包括383个E10.5细胞、383个E12.5细胞和765个E15.5细胞，鉴定了八种细胞群（图1a）。其中肢芽细胞具有同质性，均由E10.5细胞组成；E15.5细胞表现出显著的异质性，表明肢体已经开始分化（图b）；而MSSC（musculoskeletal stem cells, 肌肉骨骼干细胞）主要由E12.5细胞组成。GO功能富集显示，肢芽细胞高度表达在肢体发育成熟中起关键作用的基因，而MSSC细胞富含控制肢体发育、干细胞发育、骨骼系统发育和间充质细胞发育的基因（图 1d）。

图1 单细胞测序揭示肢体形态发生过程中的八种细胞类型

2. 肌肉骨骼系统干细胞的发育轨迹

为揭示肌肉骨骼发育轨迹，研究者选取肢芽细胞、结缔组织细胞、软骨细胞、肌肉组织细胞、MSSC 5类细胞进行拟时序分析，结果显示各类细胞分化与真实发育时间点一致（图 2a），肌肉骨骼组织细胞谱系的层次结构被重建为具有四个分支的分化轨迹。在早期分化点，Y1分支高表达Scx、Mecom、Hoxd13和Ccnb1，被鉴定为早期祖分支， Y2, Y3,Y4, Y5分支高表达基质基因Col14a1、Lum、Ogn和Dcn，被定义为分化分支（图 2d）。其中Y4分支仅由肌细胞组成，表明源自体节的肌细胞迁移到肢体中以补充肌肉骨骼系统的形成。在树状结构的末端，Y2 分支呈现硬组织分化途径，Y3 分支呈现其他软组织分化，如基质细胞亚群和腱系亚群（图 2e）。

图2 单细胞测序揭示肌肉骨骼组织细胞发育轨迹

3. 利用单细胞测序在肌肉骨骼系统发育过程中区分Scx+肌肉骨骼干细胞

由于MSSC细胞高表达Scx，经过进一步分析，研究者将所有Scx+细胞（739个），进一步细分为6种亚型：肢芽细胞、循环细胞、硬组织谱系细胞（骨软骨细胞）和软组织谱系细胞（肌腱细胞、肌肉细胞和成纤维结缔组织细胞）（图 3a）。与结果1相同，所有的肢芽细胞均来自E10.5，而其他亚群由E12.5和E15.5的细胞组成（图 3b）。

图 3 单细胞转录组分析可区分Scx标记的各种细胞谱系

4. Scx+ 细胞在肢体发育稳态中的谱系追踪

为了确定Scx+ 细胞在肢体发育中的作用，研究者通过构建杂交小鼠进行谱系追踪，结果显示小鼠发育各个阶段的肌腱和韧带组织持续表达Scx；而在E12.5小鼠中，早期软骨标记物Sox9与GFP重叠，表明Scx+细胞具有软骨形成潜力（图 4a）。E15.5之后，GFP标记的细胞延伸到整个后肢，表明Scx+细胞参与多种组织形态发生。从小鼠E10.5肢芽中纯化SCX+细胞，皮下移植到裸鼠体内。2周后，免疫荧光染色显示SCX+细胞共表达肌纤维marker基因MYH3、结缔组织基质Col1、软骨标记Sox9或成骨标记物Runx2。表明肌肉骨骼系统中Scx+细胞显示出干细胞特征。

图 4 谱系追踪显示Scx+细胞在肢体发育过程中参与肌肉骨骼系统

5. 单细胞测序揭示肢体发育过程中WT和Scx^-/-小鼠肢体的细胞异质性

为进一步明确Scx的作用，研究者选取野生型和Scx^-/-胚胎E12.5的后肢进行单细胞测序，共检测761 个细胞。其中C6亚群的所有细胞均来自Scx^-/-小鼠， C9亚群中的所有细胞均来自野生型小鼠。进一步研究发现，Mki67在C6和C9中高表达，表明这些细胞是增殖细胞（图 5c）。GO功能富集结果显示，C6和C9之间的差异基因主要与肢体形态发生、器官形态发生和骨化有关，且在C6中下调（图 5f）。表明肢体发育过程中，高度增殖的祖细胞群中，Scx基因敲除小鼠体内缺少了与肢体形态发生相关的基因。

图 5 野生型和Scx^-/-小鼠后肢的单细胞RNA-seq

6. 野生型和Scx^-/-小鼠16 种组织的RNA-Seq分析

随后研究者选取了野生型和Scx^-/-小鼠的脂肪、膀胱、骨骼、软骨、皮质、心脏等16种组织进行了常规转录组分析，对差异基因进行GO 功能富集，发现肌肉骨骼组织中有重要功能的基因一致下调，从而导致肌纤维直径变小，骨骼缺陷，跟骨的小梁骨量明显减少，形状不规则等后果（图 6f）。总之，Scx缺乏，小鼠体内肌肉骨骼是受影响最大的组织。

图 6 Scx缺乏导致肌肉骨骼系统组织的异常发育

7. Scx+细胞有助于肢体内源性修复

通过选择性地构建肌肉骨骼组织损伤模型小鼠，随后通过 DT 处理消融Scx+细胞。结果显示，对照组中损伤部位形成纤维组织和软骨样组织。而损伤模型中损伤部位有明显凹陷，表层覆盖有大量纤维组织，基质排列紊乱。表明Scx+细胞的缺失阻碍了受损组织的修复，Scx在成人肌肉骨骼损伤的愈合中起着不可或缺的作用。

参考文献：

Yin Z, Lin J, Yan R, et al (2020) Atlas of Musculoskeletal Stem Cells with the Soft and Hard Tissue Differentiation Architecture. Adv Sci (Weinh) 7:2000938. https://doi.org/10.1002/advs.202000938

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