单细胞测序|单细胞测序描述小鼠原肠胚形成和发育的轨迹

标题：A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis

期刊：Nature.

影响因子：49.96

导读

单细胞测序技术能够使我们对生物学进程的观测精确度提升到单个细胞全转录组的水平，应用到发育领域后，我们便可从整体基因表达的尺度上描述胚胎发育的轨迹。本文主要探讨原肠形成这一个关键的发育事件，在此期间，胚胎多能细胞分化成谱系特异性的前体，而后产生成年有机体。实验人员对受精后6.5 - 8.5天的9个连续时间点收集的小鼠胚胎中116,312个单细胞的转录谱进行绘制，构建了从多能性到所有主要胚胎谱系的细胞分化的分子图，并探索了内脏和原条来源的内胚层聚合的复杂事件。此外，实验人员还利用单细胞分析揭示Tal1-/-嵌合胚胎在早期中胚层分化中会表现出缺陷，从而证明了结合时间和转录信息如何能阐明基因功能。总之，这种对哺乳动物细胞在体内分化轨迹的全面描述，代表了理解基因突变在发育过程中的影响的基线，以及优化再生医学体外分化过程的路线图。

科学问题

原肠胚形成时期有着怎样的发展轨迹，涉及怎样的分子过程？

实验设计

测序细胞为来自411只小鼠全胚胎的总计116312个单细胞。这些样本分别来自第6.5-8.5天不同发育时长的小鼠胚胎，发育时长每隔6小时划分为一组，共9组样本。

测序平台

10X genomics

实验思路

实验结果

1.早起胚胎发育阶段对于单细胞图谱的绘制

通过测序对各种细胞类型加以区分，细胞聚类总计共划分出37个细胞类型，按如图所示的方式按时间顺序记录每种细胞在发育过程的数量变化，出现与消失时刻。

图1 小鼠原肠胚形成和早期器官发生的单细胞分辨率图谱

2.内胚层细胞发育图谱绘制

研究者进一步在分子水平上研究原条来源的最终内胚层与内脏内胚层来源的细胞的汇合。为此，他们按照内脏内胚层、前原条、最终内胚层和肠道细胞类型对这些来自第8.25和8.5天的胚胎细胞进行进一步细分，并如图所示划分出了咽内胚层，前肠，中肠和后肠包括细分亚群在内的共7个类群（图2a，b，c）。鉴于肠道发育在空间上存在一定的复杂度，研究人员基于拟时序构建了从前到后模拟空间顺序的细胞类群分布图（图2f）。根据基因表达的分析，研究人员也对每种细胞的祖先进行了溯源（图2g），计算出了它们是来自内脏内胚层（VE）或最终内胚层（DE）的概率，绘制了图示的分化轨迹（图2h）。

图2内胚层发育早期的分子转化和随后的分化

3.血液内皮细胞谱系的起源

在卵黄囊中红细胞会连续生成两波，一波来自原初造血作用，另一波来自卵黄囊最终造血作用。为了深入研究这两次造血过程，实验人员对红细胞，造血内皮细胞，外周血祖细胞，内皮细胞和混合中胚层细胞进行了分离，并重新聚类，得到了图示（图3a，b，BP：外周血祖细胞，EC：内皮细胞，Ery：红细胞，Haem：造血内皮祖细胞，Mes：中胚层细胞，Mk：巨核细胞，My：骨髓细胞）中的推定分化轨迹。内皮细胞在卵黄囊、尿囊和胚体中独立产生，研究人员对来自不同解剖结构进行分离，分选纯化并测序，将这些内皮细胞细胞分配到它们最可能的胚胎位置，表明不同的解剖来源可以部分解释内皮细胞中观察到的转录异质性（图3e）。先前的研究指出原初造血作用也会生成巨噬细胞和巨核细胞祖细胞，这一观点在该实验结果中得到验证，有两组细胞被分别注释为巨核细胞和髓系细胞（图3f）。以往的研究表明，早期髓系祖细胞可形成脑小胶质细胞。与此一致的是，在这次实验的骨髓细胞群体中，细胞表达Ptprc(编码CD45)、Kit、Csf1r和Fcgr3(编码CD16)，这是以前报道的产生小胶质巨噬细胞的E8.5类emp群体的标志物。

图3血液出现的时间分析揭示出早期骨髓细胞

4.TAL1基因的缺陷在造血作用方面的影响

TAL1基因的缺失会阻碍小鼠的造血功能，而构建基因敲除小鼠的模型又十分困难，因此实验人员将Tal1−/− td Tomato+胚胎干细胞注入野生型小鼠囊胚中，构建出嵌合体小鼠模型，这种胚胎的野生型部分可维持正常的造血作用。在培养至8.5天时，实验人员将两种细胞分选开来并测序，结果表明td Tomato+细胞没有促成任何造血作用，对应到图3a中的分化情况，在图4c中黑色箭头所指的位置即为分化断点。尽管有两个类群的细胞可以被划分到造血内皮细胞中，Tal1−/−细胞在血液生成基因的表达方面存在问题（图4d）。通过对每个亚群细胞组成的检验（图4e）以及基因表达情况的分析（图4f），研究人员最终发现Tal1−/−在两波造血作用中有着相似的转录状态阻断，此外，当细胞无法向着造血表型分化时EC3的Tal1−/−细胞会开始激活其他的中胚层分化程序。

图4将Tal1−/−嵌合体映射到图谱中识别出与血液内皮发育缺陷相关的分子状态

参考文献：

Pijuan-Sala, B., Griffiths, J.A., Guibentif, C. et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature 566, 490–495 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-0933-

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