文献解读|单细胞RNA测序揭示癌症相关成纤维细胞在胃癌肿瘤微环境中的特征
题目：Single-cell RNA sequencing reveals a pro-invasive cancer-associated fibroblast subgroup associated with poor clinical outcomes in patients with gastric cancer
期刊：Theranostics（IF=11.556）
样本
人胃癌患者的癌组织和邻近粘膜样本
测序平台
10X genomics
背景
癌症相关成纤维细胞 (CAFs) 的促癌活性表明它们是癌症治疗的潜在靶点。胃癌 (GC) 中 CAF 异质性的机制仍不清楚。因此，全面了解GC中CAF的分类、功能、激活阶段对治疗癌症具有重要意义。
方法
通过对8对GC患者的癌组织和邻近黏膜 (AM) 样本进行单细胞RNA测序，分析CAF亚群的特征以及受CAF亚群调控的肿瘤微环境 (TME)之间的动态通信。并进一步评估不同GC亚型中CAF的空间分布，及其与原肿瘤免疫细胞亚型之间的邻域关系。
结论
iCAFs和eCAFs不仅表现出较强的促侵袭活性，还能动员周围的免疫细胞构建有利于肿瘤发生的微环境。因此，通过抑制CAF的活化来抑制GC的生长和转移，改善“GC”预后，可能成为一种重要的 GC治疗策略。
主要结果
1. 单细胞测序揭示TME中的主要细胞类型
为全面分析人胃癌中的细胞群，作者对8名病人的GC原发性肿瘤及其相邻胃黏膜组织进行单细胞测序，共确定了七种细胞类型：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和肥大细胞。
图1胃癌单细胞图谱
2. 肿瘤来源的上皮细胞和内皮细胞表现出间充质转化特性
分别对不同细胞进行无监督聚类，每种细胞均可细分为多种亚型。其中上皮细胞是所有样本中最丰富的细胞类型，上皮细胞各亚型在患者之间存在高度异质性。差异分析和功能富集结果显示，肿瘤来源的上皮细胞中上调的基因富含恶性生物学特性，而肿瘤衍生的10亚群显示出最高的上皮向间质转化特性(p-EMT)，作者将其命名为“EMT细胞”。
内皮细胞细分后，作者找到了一个位于内皮细胞和两组成纤维细胞发育轨迹中间阶段的细胞群，内皮-间质转化（EndMT）的4亚群，作者将其命名为EndMT簇。肿瘤衍生的EndMT细胞中上调的基因与功能“TNF-alpha/NF-kappa B signaling complex 6” 和 “collagen fibril organization”相关，表明EndMT细胞参与GC中的血管生成。
成纤维细胞细分后，共鉴定到四种主要的成纤维细胞亚型：肌成纤维细胞、周细胞、细胞外基质CAF(eCAF)和免疫调节CAF(iCAF)。其中eCAF是一个以前未报道的CAF亚群，因高表达参与细胞外基质（ECM）重塑的基因而得名。eCAF还高表达与肿瘤侵袭相关的基因（MMP14、LOXL2和POSTN），表明eCAF构成了肿瘤转移TME的重要组成部分。随后作者通过分析423个TCGA GC样本的基因表达谱与预后之间的相关性，发现高表达POSTN基因的患者的总生存期较短。以上结果均表明eCAF代表了促进转移并影响GC患者预后的重要CAF亚群。
图2. GC和AM样品中的成纤维细胞
3. GC的TME呈现免疫抑制状态
T细胞是TME中数量最多的免疫细胞，无监督聚类结果显示，在UMAP图中，来自肿瘤样本与AM样本的T细胞分开聚集，表明两者功能特性存在差异。基于基因表达，共确定了八种T细胞亚型。其中耗竭T细胞，CD8-C3-PDCD1亚群表达CD69和各种细胞毒性基因，表明该亚群可能被激活；而CD4+中央记忆前体T细胞，效应T细胞，调节T细胞等在肿瘤和AM组织中有明显差异，表明T细胞的免疫功能在GC TME中明显受损。
B细胞进一步细分共确定了13个亚群。肿瘤衍生的B细胞表达的基因在“细胞对压力的反应”、“细胞死亡的正调节”和“内在的凋亡信号通路”富集，表明肿瘤样本中的B细胞经历了凋亡。
巨噬细胞浸润程度与许多实体瘤患者的不良预后相关。通过对巨噬细胞进行无监督聚类分析来探索巨噬细胞在TME中的作用，肿瘤来源的巨噬细胞中上调的基因主要与白细胞迁移、髓系白细胞活化及抗原加工和呈递等功能有关，表明肿瘤来源的巨噬细胞在调节TME中的免疫细胞浸润中发挥重要作用。
图3. 肿瘤样本和AM样本中的T细胞
4. 不同TME细胞之间的动态通信
最后作者进行了细胞间通讯分析，以研究不同成纤维细胞亚群与肿瘤微环境中其他细胞的互作情况。作者发现CAF-内皮细胞通讯由血管生成相关的VEGFA-受体对介导，证实CAF在血管生成的激活中起关键作用。此外，肿瘤中的上皮细胞与其他TME成分的相互作用比AM中的上皮细胞更强，表明肿瘤细胞受到TME中其他成分的积极调节；iCAF通过与趋化因子、炎症细胞因子和免疫调节相关的受体-配体对与CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg和巨噬细胞进行交流，表明iCAF在淋巴细胞的募集中发挥重要作用。最后作者还发现POSTN表达情况与TCGA肿瘤样本中的巨噬细胞比例密切相关，eCAF在体外表现出较强的吸引M2巨噬细胞的特性。总之，iCAFs和eCAFs在肿瘤微环境免疫细胞募集中具有不同的功能。
图4. 肿瘤微环境细胞间通讯分析
最后作者通过比较弥漫性和肠型GC患者之间的细胞组成，进一步阐明了细胞异质性与GC病理分类的相关性。弥漫型GC的特征是“四高”表型（高EMT、高基质细胞、高免疫细胞浸润和高T细胞耗竭），较多的转移性肿瘤细胞和免疫抑制性TME可能是造成弥漫性GC患者预后较差的主要原因。
参考文章：
Li X, Sun Z, Peng G, Xiao Y, Guo J, Wu B, Li X, Zhou W, Li J, Li Z, Bai C, Zhao L, Han Q, Zhao RC, Wang X. Single-cell RNA sequencing reveals a pro-invasive cancer-associated fibroblast subgroup associated with poor clinical outcomes in patients with gastric cancer. Theranostics 2022; 12(2):620-638. doi:10.7150/thno.60540.
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本文为伯豪生物原创
撰稿人：李梦洁
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