文献解读|EM-Seq从pg级DNA中以单碱基分辨率检测DNA甲基化
期刊：Genome Research（IF=9.043）
技术：EM-seq
导读
人类基因组中大约有6亿个胞嘧啶，考虑到DNA的双链结构，约存在5600万个CpGs。在哺乳动物基因组中，70%-80%的CpG被修饰，这些修饰影响基因的表达。目前基于亚硫酸氢盐转化后的测序作为甲基化检测的金标准，能够以单碱基分辨率检测5mC和5hmC。但使用亚硫酸氢盐进行处理会破坏DNA，使DNA片段化，从而导致DNA的丢失和测序数据偏倚。为了克服这些问题，开发了酶法甲基化测序（EM-seq）。该方法使用两组酶促反应来检测5mC和5hmC。在第一次反应期间，易位双加氧酶2 (TET2) 和T4-噬菌体-β-葡糖基转移酶（T4-BGT）将5mC和5hmC转化为5-羧基胞嘧啶 (5caC) 以及5-(β-葡糖氧基甲基)胞嘧啶 (5ghmC)，这些反应保护5mC和5hmC免受下游脱氨作用 ，载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A（APOBEC3A）将C脱氨至U。随后的聚合酶链式反应 (PCR) 扩增将修饰的5mC或5hmC转化为C，并将U转化为T。分别使用NA12878基因组DNA，cf DNA和FFPE DNA构建文库，在EM-seq文库检测到的5mC和5hmC与亚硫酸氢盐文库结果相似，但在特定指标（覆盖度，重复性，灵敏度等）优于亚硫酸氢盐文库。当DNA起始量为100pg时，EM-seq依然有效，并保持优势。因此EM-seq为甲基化的研究和临床应用开辟了新的途径。
研究结果
1. 5mC和5hmC的酶法检测
TET2连续三步催化5mC至5hmC、5fC和5caC的氧化（图1A）。T4-BGT将5hmC（原基因组中和TET2氧化形成）转化成5gmC（图1B）。APOBEC3A对C、5mC、并在较小程度上对5hmC进行脱氨（图1C）
图1 参与检测5mC和5hmC的酶
2. 基于EM-seq的甲基化组学
分别使用10、50和200ng的NA12878基因组DNA构建EM-seq文库和亚硫酸氢盐文库。与WGBS相比，EM-seq可以在较少的PCR循环内获得更高的文库产量（图2A）,包含更少的测序重复，产生更多可用的序列（图2B），增加了基因组的有效覆盖度。与WGBS相比，EM-seq文库的GC偏好性更标准（图2C）。
图2 EM-seq文库
在DNA起始量为10、50、200ng时，EM-seq和WGBS具有相似的CpG，CpG甲基化约为52%（图3A）。人类基因组中有5600万个CpG，使用1×到21×覆盖深度比较EM-seq和WGBS对CpG的检测。在1×的覆盖深度下，DNA起始量为10、50和200ng时，EM-seq都可以检测到大约5400万个CpG；起始量为50和200ng时，WGBS涵盖约4500万个CpG，起始量为10ng时约涵盖3600万个CpG。将覆盖深度增加到8×时，EM-seq相比WGBS，在起始量为10ng时覆盖了大约7倍的CpG，起始量为200ng时覆盖了2.2倍的CpG。当覆盖深度增加到大于11×时，WGBS覆盖了更多的CpG（图3B，C）。EM-seq在不同起始量之间的相关性比WGBS高（图3D，E），说明EM-seq对甲基化检测的灵敏度不会随着起始量的减少而降低。因此EM-seq具有更高的一致性。
图3 EM-seq准确表示甲基化
3. 100pg EM-seq文库
使用100pg至10ng NA12878基因组DNA构建低起始量的EM-seq文库，每个文库产生8.1 亿reads。EM-seq显示出均匀的GC分布（图4A）。不同起始量文库的CpG甲基化水平与预期一致，都约为53%（图4B）。在1×的覆盖深度下，起始量为1ng和10ng的EM-seq文库均涵盖5400万个CpG（图 4C）；而当起始量为10ng时， WGBS仅检测到3700万个CpG（图3B），这说明了EM-seq可以识别更多CpG。将EM-seq与RNA-seq、ATAC-seq、NOMe-seq、NicE-seq、Hi-C、组蛋白修饰和ChIP-seq等数据结合起来进行多组学比较，可以更完整的理解细胞调控。
图4 低起始量DNA构建EM-seq文库
与WGBS相比，EM-seq可实现以单碱基分辨率检测基因组甲基化，并且不破坏DNA，更加温和。另外在基因组覆盖度、CpG检测率和基因组特征识别等方面都得到了改进。EM-seq可以用于较低的起始量以及降解DNA的检测。酶促转化将加强单细胞、cfDNA或FFPE DNA的研究，有利于癌症等疾病的研究。
参考文献：
Vaisvila R, Ponnaluri VKC, Sun Z, Langhorst BW, Saleh L, Guan S, Dai N, Campbell MA, Sexton BS, Marks K, Samaranayake M, Samuelson JC, Church HE, Tamanaha E, Corrêa IR Jr, Pradhan S, Dimalanta ET, Evans TC Jr, Williams L, Davis TB. Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome Res. 2021 Jun 17;31(7):1280–9. doi: 10.1101
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