电泳结果分析
电泳分析
PCR扩不出来由很多原因，每个细节都有可能导致扩不出来哦。首先重做一遍实验，并且设阳性对照，让同学帮忙看着，以防那个组分没加，检查PCR条件，并优化。如果还扩不出来，将PCR体系中的酶、dNTP、buffer全换新，并且换台PCR仪器试试。实在不行，重新设计引物，一般我们都在设计巨多条引物时（几百）才用primer5，你可以自己设计，按照这个网站http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/计算Tm和hairpin的Tm(以小于30℃为佳)，这个是国外非常常用的。
（一）产量低或无PCR产物。
1.模板不完整。通过电泳检测模板的质量。
2. 模板纯度低。对于DNA模板，其中含有的酚(phenol）,乙二胺四乙二酸（EDTA）, 蛋白质及高金属离子浓度（如Mg2+浓度）等污染物会影响酶的活性而影响PCR反应。可以通过再次沉淀然后70%乙醇洗涤来进一步纯化DNA。.
3.错误的引物设计。对于DNA模板的引物，可以使用相关软件进行设计。
4.酶用量不足或效率低。酶应贮存在-20℃冰箱，现用现拿，避免酶长期暴露在室温而失活，因此可以适当增加酶的用量，但酶用量过多会导致非特异性扩增。
5.引物用量不足或效率低。引物应贮存在-20℃，避免反复冻融。构建PCR体系时一定在冰上操作，所有试剂都应插在冰上。
6.Mg2+量不足。如果Mg2+浓度过低，则会导致PCR产量降低。由于Mg2+浓度能够受引物、dNTPs,模板的影响，故Mg2+浓度必须相应的进行调整以获得最大产量。若模板中含有EDTA等金属螯合剂时，必须相应提高Mg2+浓度（一分子的EDTA能够结合一分子的Mg2+）。在某些需要高浓度的dNTPs的PCR反应中，由于dNTPs能够结合 Mg2+形成复合体，故必须相应增加Mg2+浓度。
7.模板GC含量丰富。对于DNA模板，可以适当提高退火温度。对于RNA模板，若GC含量丰富或具有二级结构，则可以适当提高一下反转录温度。
（二）无特异性PCR产物。
1.错误的引物。重新设计引物。
2.在室温下建立PCR体系。当PCR体系在室温下建立时，Taq酶在建立的过程中表现为低的但是显著性的活性，结果PCR反应中会出现非特异性扩增。为了避免这种现象若使用Taq聚合酶，须在冰上进行操作。也可使用热启动酶，该酶在室温下没有活性，只有处在高温的PCR反应中才具有活性。
3. Mg2+浓度过高。如果Mg2+浓度过高，则会出现非特异性扩增。推荐的使用浓度为1—4mM。如果Taq Buffer 中含有KCl则起始的Mg2+浓度为1.5mM，如果Taq Buffer 中含有(NH4)2SO4，则Mg2+起始浓度为2mM。
4.模板量过高。在50ul体系中，对于质粒和片段DNA,最佳的模板用量为0.01—1ng，而对于基因组DNA则为0.1—1ug。过多的模板将导致非特异性扩增。
5.退火温度不合适。为提高特异性，也可在最初的5个循环使用Tm高的引物作为Tm，后面的循环使用Tm低的，即采用Touch down PCR。
（三）PCR产物序列错误。
1.低保真度的耐热DNA聚合酶。对于下游的一些反应例如克隆、定点突变需要高保真度的DNA聚合酶，如pfu Polymerase。
２．Mg2+浓度过高。Mg2+浓度过高，就会降低PCR的保真性。推荐的使用浓度为1—4mM。标准的dNTP浓度为0.】
2mM的PCR反应，如果Taq Buffer 中含有KCl则起始的Mg2+浓度为1.5mM，如果Taq Buffer 中含有(NH4)2SO4，则Mg2+起始浓度为2mM。
３．非最佳的模板量。在50ul体系中，对于质粒和片段DNA,最佳的模板用量为0.01—1ng，而对于基因组DNA则为0.1—1ug。如果模板量过低，则会降低PCR反应的精确性。
4.暴露于紫外线下。为避免紫外线的伤害而造成序列的突变，可采用以下两种方法一是在切胶的过程中用长波长的紫外线（360nm）二是需要回收的DNA在跑电泳时将同一样品分两道跑，一道跑大部分的DNA，另一道跑能够在紫外线下分辨的DNA的量即可，在电泳结束后将含量多的用刀切下，少的用于紫外线下确定位置，然后通过比较将含量多的相同位置的胶切下用于回收。
5.错误的引物设计.
DNA 模板：避免两对引物之间直接重复，碱基对互补或自我互补，防止产生不需要的产物。
RNA模板：为了避免对基因组DNA的扩增，设计引物时位置应设在内含子和外显子交界处。也可以使用DNase I从RNA中除去基因组DNA。
（四）PCR产物出现在阴性对照中。
1.提取RNA中含有基因组DNA的污染，故在反转录前用DNAase Ⅰ将DNA消化。
2.错误的引物设计。
DNA 模板：避免两对引物之间直接重复，碱基对互补或自我互补，防止产生不需要的产物。
RNA模板：为了避免对基因组DNA的扩增，设计引物时位置应设在内含子和外显子交界处。也可以使用DNase I从RNA中除去基因组DNA。
Refferences
1. Rand, K.N., Crystal Violet can be usedto Visualize DNABands during Gel Electrophoresis and to Improve Cloning Efficiency,Elsevier Trends Journals Technical Tips, Online,T40022, 1996.
2. Adkins, S., Burmeister, M., Visualization ofDNA in agarosegels and educational demonstrations, Anal Biochem., 240(1),17-23, 1996.3. Hu,G., DNA Cell Biol.,12, 763-770, 1993.
4. Longo, M.C., et al., Use of uracil DNAglycosylase to con-trol carry-over contamination in polymerase chainreac-tions, Gene 93, 125-8, 1990.
5.fermanent材料
补充知识：PCR反应参数
１．预变性。预变性的目的就是破坏DNA的二级结构，使ＤＮＡ充分变性，以便于引物与模版的结合，尤其对于结构复杂的基因组DNA，这一步更是必不可少的。
２．循环阶段。
①变性：一般９４℃，具体参照酶说明书。
②退火：引物与模版结合。其中退火温度会由于引物的不同而有所不同的。退火温度的计算可以有两种方法。一是引物设计时引物设计软件提供了一个参考的退火温度可以参考使用。二是Tm 值也可以根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。两种引物的Tｍ值往往在引物合成单上被注明，故可以直接查阅。在确定退火温度时，往往是使用Tm低的引物的Tm减去5℃作为退火温度的一个基点向上向下（±10°C）摸索退火温度。为提高特异性，也可在最初的5个循环使用Tm高的引物作为Tm，后面的循环使用Tm低的。由于低的退火温度可以使引物与模板很好的结合，高的退火温度可以提高特异性，故在确定退火温度时应设置梯度，并不断优化，以确定最终的退火温度。对于丰度极低的模板的PCR,特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT PCR)得到的cDNA模板,在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度,然后再行正常的退火温度,这样能明显提高PCR的成功率。退火温度高为什么特异性好呢？因为退火温度高非特异性结合会使引物与模板结合不牢固而容易解离下来，不能进行扩增，因而只有特异结合引物扩增模板，获的目的条带
③延伸：一般７２℃，对于扩增长片段（>=3kb）的PCR，一般采用68℃。延伸速度一般为1kb/min，具体的参见酶说明书。
④关于循环次数。一般采用25—35次，不可采用过多的循环次数，达到需要的量即可。具体要参照模板的量和希望得到的PCR产物的产量。
３．后延伸。循环结束之后最后的一步延伸主要起的作用是：
①使PCR反应完全，从而提高PCR产量。
②产物末端加A尾的作用，因而可以直接用于TA克隆。
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