PCR知识知多少
实验原理
PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而体外PCR反应同样需要类似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列，实现对特定位置的扩增；PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境；反应过程同生物体内一样，DNA双链打开，引物结合模板，延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链，而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链，在退火温度处引物结合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子，进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
类型
1.菌落PCR（Colony PCR）不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快捷，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。
2.降落PCR（touch－downPCR）：降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和循环参数，而是用一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而不得到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应；设计多循环反应的程序，使相连循环的退火温度越来越低、由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中一直处于主导地位。由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在降落PCR中必需应用热启动技术。当引物和模板的同源性未知时，降落PCR尤其有价值，当引物是根据氨基酸序列设计的简并引物时，或者扩增多基因家族成员时，或者想进行进化PCR时经常会碰到这种情况。编设降落PCR程序的目的是要设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。目前大多数的PCR仪上都可以很方便地进行降落PCR。递减PCR通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP® DNA 指纹分析。原理就在于，温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率（此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争）。但是，退火温度TOUCH DOWN无法改善扩增效率低的问题，一般用于在杂模板中提高扩增特异性
3.巢式PCR(Nest PCR):一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
4.不对称PCR
低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。两个引物的浓度相差100倍
5.RT-PCR
反转录RCR（reversetranscription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。反转录RCR是以mRNA为模板进行反转录反应得到cDNA，然后以cDNA为模板通过PCR进行DNA扩增。而实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
6.加端PCR! W6 D, E% r0 J) g9 U& B:X, F
加端PCR（add-pcr）是使扩增产物的5’-末端加一段DNA顺序的PCR。设计加端PCR的引物时，除与模板配对的那一部分外再加上若干碱基，这样使扩增产物的末端加上额外一段DNA，如加上一个限制酶的识别顺序或特定功能的DNA片段。stoflet等报道在结构基因前加上噬菌体t7的启动子，当然也可用于DNA片段的末端标记或引入特定的点突变。末端可加碱基的数量与引物的长短有关，当引物足够长时扩增产物或末端甚至可以加上十几个到几十个碱基。
衔接物连接后PCR可以通过设计引物扩增验证是否已经连接上
模板
1.模板可以是多种形式，主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNA、PCR产物，cDNA等，但不能为RNA。对于不同类型的模板，其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够，质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2min、PCR产物预变性2min即可。
注意cDNA为单链DNA，但仍可做PCR的模板，只不过在第一轮循环时只有一个引物结合，合成另一条链。从第二轮开始，两个引物均与特异位点结合，从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增，原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶，只能特意识别DNA链。
2.对于模版的量来说，一般25ul体系DNA的质量为50—100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂，提取的浓度也往往比较大，为防止浓度过大对PCR造成影响，故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单，且提取浓度一般较低，则无需稀释。
引物
１．一般引物用贮液浓度为10uM。对于刚合成的引物可以根据期管壁上的说明计算稀释至10uM即可（一般引物说明上配制的浓度往往过高，所以必须稀释至10uM才能利用实验室最小刻度（0.5ul）的移液器取到）。另外引物一旦稀释完毕，应注意分装小份，防止在用的过程中反复冻融引物而造成引物的失效。
2.一般25ul反应中引物用量为0.5ul（终浓度要求为为0.1——1uM），若引物若放置时间比较长，则可以适当增加引物的用量。引物用量过多，容易导致引物二聚体（电泳时位于前方不成条带的小片段）的出现。
附：
1.引物稀释的方法：配制时首先将合成的引物12000r/min离心5min，室温静置１分钟，然后再慢慢打开管盖，根据引物合成单（或储存引物的离心管）说明加入一定量的灭菌水（引物说明是加入Buffer，此处加入无菌水即可）以达到10uM的浓度，在漩涡振荡器上充分振荡5-10min，即配成10um的贮存液，-20℃保存备用
PCRbuffer
一般PCR Buffer为10×的，使用时终浓度应为1×。如25ul体系中，应加入10×PCR Buffer为2.5ul。另外使用时应注意是否添加了Mg2+，若没有，则需要再单独添加，有则无需。
Mg2+
推荐用量为１—４ｍM。浓度过低，影响PCR产物的产量，而浓度过高，则出现非特性扩增。在PCR反应中Mg2+浓度，需进行优化。
三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）
避免反复冻融，应分装小份。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度，常用浓度为0.2 mM。 据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq酶的活性。需要注意的是dNTP与Mg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合，使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响Taq 酶的活性。
Taq酶
PCR使用的Taq酶在反应时由于丧失3’——>5’外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反应中，taq酶造成的错误的核苷酸错误的掺入率大概为每20000个核苷酸中就有一个，虽然表面上看起来不会有多大的影响，但是在分子克隆中如果有一个错误核苷酸掺入，很有可能造成移码突变，影响是严重的。为弥补taq酶这一缺点常将克隆后的序列进行测序，来确认所扩增序列的准确性。同时也可采用保真度更高的Pfu DNA Polymerase，来确保扩增的准确性，Pfu DNA Polymerase有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端，不能进行Ta克隆！而解决此问题的办法是使用TaqPlus DNA Polymerase，该酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保证准确性又能保证能够进行Ta克隆。在使用中应该注意如下问题：
1．25ul体系中一般用量为0.1ul（用枪头沾一下即可），用量过多可能会出现非特异性扩增。
2.PCR体系构建过程中最后加入的一种成分，因此只有在其他试剂加完之后才可从冰箱中取出加入。
3.Taq酶中含有甘油，故不结冰，若结冰则应丢弃。
4.对于预变性时间较长的PCR反应，应在预变性即将结束后加入酶，减少长时间高温对酶活力造成的损伤。
5.保存时间过长的酶可以适当增加用量。
体系构建
1.加样原则是酶最后加，倒数第二加的为模板。加样时应从离心管底部将各成分依螺旋式上升的方式加到管壁上。如果做多管PCR，那么按照如下方法计算出公共成分做n管时所需总体积然后混合均匀之后再分装到各个离心管中去，这样可以有效地避免误差及污染。
V总 =V标×（n+1）
其中V总需配制的总体积V标每管PCR反应需要某成分的标准体积，n表示所做PCR的管数。
2设立适当的阳性对照和阴性对照，检测PCR各试剂的可用性及污染性，便于对电泳结果准确的分析。
预实验
准备一个冰盒，并将做PCR的各试剂（除酶）、模板及无菌水放到冰上融化，设置PCR仪上反应程序。
实验步骤
下列步骤均在冰上操作
1. 取1.5ml离心管，加入各公共成分（除酶）的V总，然后分装于各PCR管中，最后将酶加入。
2. 瞬时离心10s，将各成分混匀。
3. 放入PCR仪反应。
4. 4℃冰箱保存。
5. 电泳检测。
注：常用于PCR的DNA聚合酶多要求反应必须冷启动，即反应必须在瞬间从低温达到变性温度（一般94℃）。但有些酶需要热启动，则无需在冰上操作，但酶同样还是需要现用现取，保持酶的最大活性。
示例 PCR反应体系（25µl）及条件如下：
质粒DNA 0.5µl
上游特异性PCR引物 0.5µl
下游特异性PCR引物 0.5µl
10×PCR buffer 2.5µl
Mg2+ 1.5µl
dNTP 0.5µl
Taq PCR聚合酶 0.1µl
灭菌水 18.9µl
预变性 94℃ 2min
变性 94℃ 30s
退火 59℃ 30s
延伸 72℃ 1min
循环数 30 cycles
后延伸 72℃ 10min
电泳分析
PCR扩不出来由很多原因，每个细节都有可能导致扩不出来哦。首先重做一遍实验，并且设阳性对照，让同学帮忙看着，以防那个组分没加，检查PCR条件，并优化。如果还扩不出来，将PCR体系中的酶、dNTP、buffer全换新，并且换台PCR仪器试试。实在不行，重新设计引物，一般我们都在设计巨多条引物时（几百）才用primer5，你可以自己设计，按照这个网站http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/计算Tm和hairpin的Tm(以小于30℃为佳)，这个是国外非常常用的。
（一）产量低或无PCR产物。
1.模板不完整。通过电泳检测模板的质量。
2. 模板纯度低。对于DNA模板，其中含有的酚(phenol）,乙二胺四乙二酸（EDTA）, 蛋白质及高金属离子浓度（如Mg2+浓度）等污染物会影响酶的活性而影响PCR反应。可以通过再次沉淀然后70%乙醇洗涤来进一步纯化DNA。.
3.错误的引物设计。对于DNA模板的引物，可以使用相关软件进行设计。
4.酶用量不足或效率低。酶应贮存在-20℃冰箱，现用现拿，避免酶长期暴露在室温而失活，因此可以适当增加酶的用量，但酶用量过多会导致非特异性扩增。
5.引物用量不足或效率低。引物应贮存在-20℃，避免反复冻融。构建PCR体系时一定在冰上操作，所有试剂都应插在冰上。
6.Mg2+量不足。如果Mg2+浓度过低，则会导致PCR产量降低。由于Mg2+浓度能够受引物、dNTPs,模板的影响，故Mg2+浓度必须相应的进行调整以获得最大产量。若模板中含有EDTA等金属螯合剂时，必须相应提高Mg2+浓度（一分子的EDTA能够结合一分子的Mg2+）。在某些需要高浓度的dNTPs的PCR反应中，由于dNTPs能够结合 Mg2+形成复合体，故必须相应增加Mg2+浓度。
7.模板GC含量丰富。对于DNA模板，可以适当提高退火温度。对于RNA模板，若GC含量丰富或具有二级结构，则可以适当提高一下反转录温度。
（二）无特异性PCR产物。
1.错误的引物。重新设计引物。
2.在室温下建立PCR体系。当PCR体系在室温下建立时，Taq酶在建立的过程中表现为低的但是显著性的活性，结果PCR反应中会出现非特异性扩增。为了避免这种现象若使用Taq聚合酶，须在冰上进行操作。也可使用热启动酶，该酶在室温下没有活性，只有处在高温的PCR反应中才具有活性。
3. Mg2+浓度过高。如果Mg2+浓度过高，则会出现非特异性扩增。推荐的使用浓度为1—4mM。如果Taq Buffer 中含有KCl则起始的Mg2+浓度为1.5mM，如果Taq Buffer 中含有(NH4)2SO4，则Mg2+起始浓度为2mM。
4.模板量过高。在50ul体系中，对于质粒和片段DNA,最佳的模板用量为0.01—1ng，而对于基因组DNA则为0.1—1ug。过多的模板将导致非特异性扩增。
5.退火温度不合适。为提高特异性，也可在最初的5个循环使用Tm高的引物作为Tm，后面的循环使用Tm低的，即采用Touch down PCR。
（三）PCR产物序列错误。
1.低保真度的耐热DNA聚合酶。对于下游的一些反应例如克隆、定点突变需要高保真度的DNA聚合酶，如pfu Polymerase。
２．Mg2+浓度过高。Mg2+浓度过高，就会降低PCR的保真性。推荐的使用浓度为1—4mM。标准的dNTP浓度为0.】
2mM的PCR反应，如果Taq Buffer 中含有KCl则起始的Mg2+浓度为1.5mM，如果Taq Buffer 中含有(NH4)2SO4，则Mg2+起始浓度为2mM。
３．非最佳的模板量。在50ul体系中，对于质粒和片段DNA,最佳的模板用量为0.01—1ng，而对于基因组DNA则为0.1—1ug。如果模板量过低，则会降低PCR反应的精确性。
4.暴露于紫外线下。为避免紫外线的伤害而造成序列的突变，可采用以下两种方法一是在切胶的过程中用长波长的紫外线（360nm）二是需要回收的DNA在跑电泳时将同一样品分两道跑，一道跑大部分的DNA，另一道跑能够在紫外线下分辨的DNA的量即可，在电泳结束后将含量多的用刀切下，少的用于紫外线下确定位置，然后通过比较将含量多的相同位置的胶切下用于回收。
5.错误的引物设计.
DNA 模、板：避免两对引物之间直接重复，碱基对互补或自我互补，防止产生不需要的产物。
RNA模板：为了避免对基因组DNA的扩增，设计引物时位置应设在内含子和外显子交界处。也可以使用DNase I从RNA中除去基因组DNA。
（四）PCR产物出现在阴性对照中。
1.提取RNA中含有基因组DNA的污染，故在反转录前用DNAase Ⅰ将DNA消化。
2.错误的引物设计。
DNA 模板：避免两对引物之间直接重复，碱基对互补或自我互补，防止产生不需要的产物。
RNA模板：为了避免对基因组DNA的扩增，设计引物时位置应设在内含子和外显子交界处。也可以使用DNase I从RNA中除去基因组DNA。
Refferences
1. Rand, K.N., Crystal Violet can be usedto Visualize DNABands during Gel Electrophoresis and to Improve Cloning Efficiency,Elsevier Trends Journals Technical Tips, Online,T40022, 1996.
2. Adkins, S., Burmeister, M., Visualization ofDNA in agarosegels and educational demonstrations, Anal Biochem., 240(1),17-23, 1996.3. Hu,G., DNA Cell Biol.,12, 763-770, 1993.
4. Longo, M.C., et al., Use of uracil DNAglycosylase to con-trol carry-over contamination in polymerase chainreac-tions, Gene 93, 125-8, 1990.
5.fermanent材料
PCR反应参数
１．预变性。预变性的目的就是破坏DNA的二级结构，使ＤＮＡ充分变性，以便于引物与模版的结合，尤其对于结构复杂的基因组DNA，这一步更是必不可少的。
２．循环阶段。
①变性：一般９４℃，具体参照酶说明书。
②退火：引物与模版结合。其中退火温度会由于引物的不同而有所不同的。退火温度的计算可以有两种方法。一是引物设计时引物设计软件提供了一个参考的退火温度可以参考使用。二是Tm 值也可以根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。两种引物的Tｍ值往往在引物合成单上被注明，故可以直接查阅。在确定退火温度时，往往是使用Tm低的引物的Tm减去5℃作为退火温度的一个基点向上向下（±10°C）摸索退火温度。为提高特异性，也可在最初的5个循环使用Tm高的引物作为Tm，后面的循环使用Tm低的。由于低的退火温度可以使引物与模板很好的结合，高的退火温度可以提高特异性，故在确定退火温度时应设置梯度，并不断优化，以确定最终的退火温度。对于丰度极低的模板的PCR,特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT PCR)得到的cDNA模板,在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度,然后再行正常的退火温度,这样能明显提高PCR的成功率。退火温度高为什么特异性好呢？因为退火温度高非特异性结合会使引物与模板结合不牢固而容易解离下来，不能进行扩增，因而只有特异结合引物扩增模板，获的目的条带
③延伸：一般７２℃，对于扩增长片段（>=3kb）的PCR，一般采用68℃。延伸速度一般为1kb/min，具体的参见酶说明书。
④关于循环次数。一般采用25—35次，不可采用过多的循环次数，达到需要的量即可。具体要参照模板的量和希望得到的PCR产物的产量。
３.后延伸。循环结束之后最后的一步延伸主要起的作用是：
①使PCR反应完全，从而提高PCR产量。
②产物末端加A尾的作用，因而可以直接用于TA克隆。