Nature综述：mRNA疫苗的前世今生

界已经有数亿人接种mRNA新冠疫苗，随着诺贝尔奖的陆续揭晓，关于谁应该作为这项技术的先驱获得荣誉的争论也在持续升温。不过诺奖是一个只授予少数科学家的奖项，无法表彰mRNA医学发展中的众多贡献者。实际上，研制mRNA疫苗的过程是依靠数百名研究人员30多年来共同努力的成果。今天小编就和大家分享一篇今年九月发表在Nature(IF:49.963)杂志上关于mRNA疫苗历史的综述，让我们一起了解下mRNA疫苗的前世今生吧。

mRNA疫苗的混乱历史

mRNA起源

故事的开始是1987年末Robert.Malone进行了一项具有里程碑意义的实验：将mRNA链与脂肪滴混合，使沐浴在这种基因混合物中的人类细胞吸收mRNA并产生蛋白质。当时还是加州Salk生物研究所研究生的Malone意识到这一发现可能在医学上产生深远的影响，因此在后来他草草写下了一些笔记，并在上面签名注明日期（图1）。他在1988年1月11日写道如果细胞可以从传递到它们体内的mRNA生成蛋白质，就有可能把RNA当作药物来治疗疾病。同年晚些时候，Malone的实验又表明青蛙胚胎能够吸收这些mRNA。这是第一次有人使用脂肪滴来促进mRNA进入活体。这些实验也是通向历史上最重要和最有利可图的mRNA新冠疫苗的基石。

图1 Malone的实验笔记：描述了1989年用于注射小鼠的mRNA的合成 

回顾mRNA疫苗的历史（图2），会发现通往成功的道路并不是一帆风顺的。Malone的实验本身借鉴了其他研究人员的成果。早在1978年，科学家们就利用脂肪膜结构的脂质体将mRNA运输到小鼠和人类细胞中，以诱导蛋白质表达。脂质体包裹并保护mRNA，然后与细胞膜融合，将遗传物质传递到细胞中，这是建立在脂质体和mRNA多年研究基础上的，它们都是在20世纪60年代发现的。然而，当时很少有研究人员把mRNA作为一种医疗产品来考虑，主要因为还没有一种方法能够在实验室中制造这种遗传物质。相反，多数人用它来研究基本的分子过程。大多数科学家从兔子血液、培养的小鼠细胞等来源中重新使用mRNA。并且在之后的很多年里，人们都认为mRNA太不稳定而且价格昂贵，无法用作药物或疫苗。几十个学术实验室和公司都在研究这个想法，努力寻找脂肪和核酸的正确配方，而这些正是mRNA疫苗的组成部分。

在1984年，Krieg和生物学家Douglas·Melton及分子生物学家Tom·Maniatis和哈佛大学的Michael·Green等人利用从病毒中提取的RNA合成酶等在实验室得到了具有生物活性的mRNA，这一核心方法至今仍在使用。然后Krieg将实验室制造的mRNA注射到青蛙的卵子中，证明它的工作原理与真实一样。Melton和Krieg都认为合成mRNA主要是作为研究基因功能和活性的工具。直到1987年，在Melton发现mRNA可以激活和阻止蛋白生产后，他才帮助成立一家公司探索使用合成RNA阻止靶基因表达治疗疾病，但在他的实验室里仍然没有人想到疫苗。Krieg说RNA通常以难以置信的不稳定性而闻名，RNA周围的一切都需要很谨慎。因此，哈佛大学技术开发办公室决定不申请RNA合成方法的专利，研究人员只是将试剂交给了一家叫Promega的公司，这是一家实验室用品公司，作为回报他们得到了少量的版税和一箱香槟。如今，mRNA疫苗中包括化学修饰的RNA和不同类型的脂肪泡，这已经包括了Malone发明的创新。但自称是mRNA疫苗发明者的Malone仍认为，他的工作还没有得到足够的认可，他说自己应该被写进历史。

图2 mRNA疫苗历史

专利纠纷

时间来到几年后，Malone使用哈佛团队的方法合成了mRNA，但他添加了一种带正电荷的新型脂质体增强了与带负电荷的mRNA主链结合的能力。这些脂质体是由生物化学家Philip·Felgner开发的。尽管Malone成功地利用脂质体将mRNA传递到人类细胞和青蛙胚胎中，但他却从未获得博士学位，因为他和Salk的导师Inder·Verma不合。他早在1989年就离开了研究生院，到Vical公司为Felgner工作。在那里，他们和威斯康星大学麦迪逊分校的合作者表明脂质mRNA复合物可以刺激小鼠体内产生蛋白质。

在这以后事情变得混乱起来。1989年3月，Vical和Salk都开始申请专利，不过Salk公司很快就放弃了。1990年，Verma（Malone的导师）加入了Vical公司的咨询委员会，Malone认为Verma和Vical达成了一项幕后交易，使相关的知识产权落入了Vical手中。Malone只被列为几个发明人之一，不再从随后的授权交易中获得个人利益。因此Malone宣称他们利用他的思想致富。但Verma和Felgner断然否认了Malone的指控。Verma表示完全是胡说八道，他说放弃专利申请的决定取决于Salk的技术转让办公室。在1989年8月Malone离开了Vical，理由是他与Felgner在科学判断和学术贡献上存在分歧。在进入学术界工作之前，他完成了医学院的学业，并接受了一年的临床培训。在学术界，他试图继续研究mRNA疫苗，但难以获得资金。因此他开始专注于DNA疫苗和传递技术。2001年，他开始从事商业和咨询工作。在过去的几个月里，他开始公开抨击mRNA疫苗的安全性，不过正是他的研究才使这种疫苗成为可能。Malone举例说，疫苗产生的蛋白质会破坏人体细胞，而且疫苗接种的风险超过了好处，但这些说法被其他科学家和卫生官员一再驳斥。

而在Malone离开Vical后，Vical在1991年与世界最大的疫苗开发企业之一美国Merck公司签订了价值数百万美元的研究合作。Merck公司的科学家评估了老鼠的mRNA技术想要制造流感疫苗，但后来放弃了这一方法。Merck公司前科学家effrey·Ulmer说是生产成本和可行性让他们踌躇不前。法国一家名为Transgène的小型生物技术公司的研究人员也有同感。在那里由Pierre· Meulie领导的一个小组与工业界和学术界的伙伴合作，1993年首次证明脂质体中的mRNA可以在小鼠体内引发特定的抗病毒免疫反应。Transgène的研究人员为他们的发明申请了专利，并继续研究mRNA疫苗。但Meulie估计他需要至少1亿美元来优化平台，他不打算为这样一个棘手、高风险的项目要那么多钱。因此在Transgène的母公司停止支付维持该专利的费用后，该专利失效了。与Merck公司的研究小组一样，Meulie的研究小组也将重点转向了DNA疫苗和其他载体运载系统，最终产生了一些用于兽医应用的疫苗，例如防止养鱼场感染的疫苗。就在上个月，印度监管机构紧急批准了世界上第一个用于人类的DNA疫苗，以帮助预防COVID-19。尽管DNA疫苗在人类身上取得成功的速度很慢，但行业对DNA技术的协同推进对RNA疫苗也有好处，一位叫Ulmer的人说，从生产考虑和监管经验到序列设计和分子研究，从DNA中学到的许多东西都可以直接应用于RNA，这为RNA的成功提供了基础。

不断奋斗

在20世纪90年代和21世纪头十年的大部分时间里，几乎所有考虑开发mRNA疫苗的公司都选择了将资源投资到别处。毕竟传统观点认为，mRNA太容易降解，而且生产成本太高。而30年前率先研制出一种自我扩增RNA疫苗的病毒学家Peter·Liljeström说这是一场持续的奋斗。另一位1989年创立第一家专注于RNA的实验室用品公司Ambion的Matt·Winkler也说RNA很难处理，他曾表示如果当时问是否可以把RNA注射到别人体内来制造疫苗他一定会嘲笑。不过mRNA疫苗在肿瘤学领域受到了更大的欢迎，它被当作一种治疗药物，而不是用来预防疾病。从基因治疗师David·Curiel的工作开始，一些科学家和公司都在探索mRNA是否可以用于治疗癌症。他们觉得如果mRNA编码了癌细胞表达的蛋白质，那么将其注射到体内可能会训练免疫系统攻击这些细胞。Curiel已经在老鼠身上取得了一些进展，不过他表示当向Ambion咨询商业化的机会时，该公司表示看不到该技术的任何经济潜力。另一位癌症免疫学家Eli·Gilboa取得了更大的成功他从血液中提取免疫细胞，诱导它们吸收合成编码肿瘤蛋白的mRNA，然后把这些细胞注射回体内，在那里可以组织免疫系统攻击潜伏的肿瘤，他也和杜克大学医学中心的同事们在老鼠身上证明了这一点，这导致了第一家mRNA治疗公司于1997年成立。到20世纪90年代末时Gilboa的学术合作伙伴开始人体试验，他的商业附属公司也进行了自己的临床研究。直到几年前一种晚期候选疫苗在一次大型试验中失败前这种方法一直看起来很有希望。现在它基本上过时了，但是Gilboa的工作产生了重要的影响，它启发了德国CureVac和BioNTech两家公司的创始人开始研究mRNA。这两家公司是目前最大的mRNA公司。CureVac的Ingmar·Hoerr和BioNTech的Uğur Şahin表示在了解Gilboa所做的事情后，他们也想做同样的事情，不过要直接将mRNA注入人体。现在就职于佛罗里达迈阿密大学米勒医学院的Gilboa说，这是一个雪球效应。

加速启动

Hoerr是第一个取得成功的人。他2000年在德国Tübingen大学发现直接注射可以引起小鼠的免疫反应。同年，他创建了CureVac。但几乎没有科学家或投资者对此感兴趣。在一次会议上，Hoerr展示了早期老鼠数据，他说有一个诺奖获得者坚决否定了他的发现。不过最终随着的资金慢慢流入他们在几年后开始了人体测试。该公司当时的首席科学官Steve·Pascolo是第一个研究对象，他给自己注射了mRNA，现在他的腿上仍留有头部一样大的白色疤痕，这是皮肤科医生为分析做穿刺活检留下的。不久之后，一项更正式的试验开始了，该试验涉及针对皮肤癌患者的肿瘤特异性mRNA。Şahin和他的免疫学家妻子Özlem Türeci也在20世纪90年代末开始研究mRNA，但等了比Hoerr更长的时间才创办了一家公司（图3）。他们多年来一直致力于这项技术，获得了专利、论文和研究经费。2007年他们向投资者推销了一项商业计划表示如果成功将是突破性的，他获得了1.5亿美元的种子资金。同一年，一家名为RNARx的mRNA公司获得了一笔数额更小的资金美国政府向小企业提供的97396美元资助。该公司的创始人、生物化学家Katalin Karikó和免疫学家Drew Weissman当时都在费城的宾夕法尼亚大学工作，他们有了一些现在被认为是关键的发现：改变部分mRNA代码有助于合成mRNA绕过细胞的固有免疫防御。

图3 Şahin和他的免疫学家妻子Özlem Türeci

真知灼见

Karikó在20世纪90年代一直在实验室辛苦工作（图4），目标是将mRNA转化到药物平台，不过资助机构一直拒绝她的资助申请。1995年在多次被拒绝后，她被要求离开宾夕法尼亚大学或接受降职和减薪。最终她选择留下来继续顽强追求改进Malone的方案并设法诱导细胞产生具有治疗意义的大而复杂的蛋白质。1997年她开始与Weissman合作，当时Weissman刚刚在宾夕法尼亚大学建立了一个实验室。他们一起计划开发一种基于mRNA的艾滋病疫苗。但是当Karikó将mRNA注射到小鼠体内后，引发了大量的炎症反应。她和Weissman很快就发现了原因：合成的mRNA激发了一系列被称为Toll样受体的免疫传感器，这些受体对病原体发出的危险信号起首要反应。2005年他们报告说重新排列mRNA的核苷酸尿苷上的化学键，产生一种类似物“伪尿苷”，似乎可以阻止人体将该mRNA识别为敌人。当时很少有科学家认识到这些修饰过的核苷酸的治疗价值。不过科学界很快意识到它们的潜力，2010年9月干细胞生物学家Derrick·Rossi领导的一个团队描述了如何利用修饰过的mRNA将皮肤细胞转化为胚胎样干细胞，然后转化为收缩的肌肉组织，这一发现引起了轰动。Derrick·Rossi被《时代》杂志评为2010年的重要人物之一。他在剑桥与人共同创立了一家名为Moderna的公司。Moderna曾试图得到宾夕法尼亚大学为Karikó s和Weissman改良mRNA申请专利的许可。但在未能与RNARx达成协议后，宾夕法尼亚大学选择了快速支付。2010年2月它授予麦迪逊一家小型实验室试剂供应商独家专利权。现在更名为Cellscript的这家公司只在这笔交易中支付了30万美元但它将继续从Moderna和BioNTech获得数亿美元的再授权费，这两家公司是首批COVID-19 mRNA疫苗的创始者，这两种疫苗都含有修饰过的mRNA。与此同时，RNARx用掉了80万美元的小企业拨款，并于2013年停止运营，此时Karikó加入了BioNTech。

图4 Karikó

真假争论

Karikó和Weissman的发现是否对mRNA疫苗的成功至关重要，研究人员仍存在争议。Moderna一直使用修饰过的mRNA，但该行业其他一些人没有。Shire制药公司的研究人员推断，如果添加正确的帽状结构并去除所有杂质，未经修饰的mRNA同样有效。Shire公司的研究负责人Michael Heartlein表示这是RNA的质量问题。Shire公司将其mRNA组合出售给了位于剑桥的生物公司Translate，并继续推进这项技术。尽管Translate的一些人类数据表明其mRNA不会引发不良免疫反应，但其平台仍有待临床验证，他们的COVID-19候选疫苗仍在人类试验早期。不过法国制药巨头Sanofi已经被该技术的前景所说服，2021年8月该公司宣布计划以32亿美元收购Translate。与此同时CureVac也改变mRNA的基因序列以最大限度地减少疫苗中的尿苷含量作为缓解策略。经过20年的努力该公司的狂犬疫苗和COVID-19候选疫苗早期试验都取得了成功。但6月份的后期试验数据显示，CureVac的冠状病毒候选疫苗的防护性远远低于Moderna或BioNTech的疫苗。因此，部分mRNA专家认为“伪尿苷”是该技术的重要组成部分，并表示Karikó和Weissman的发现是值得认可和奖励的。位于剑桥的合成生物学公司Strand Therapeutics的联合创始人兼首席执行官Jake Becraft表示，在这方面，真正的赢家是修饰过的RNA。该公司致力于研究基于mRNA的疗法。不过不是每个人都这么肯定，我国苏州阿博根生物科技有限公司首席执行官薄颖表示，有多种因素可能会影响mRNA疫苗的安全性和有效性，mRNA的化学修饰只是其中之一。该公司研发的新冠mRNA疫苗目前处于后期临床试验阶段，该产品使用未经修饰的mRNA。

脂质突破

说到关键技术，许多专家强调了另一项对mRNA疫苗至关重要的创新，一种微小的被称为脂质纳米颗粒(LNPs)脂肪泡，它保护mRNA并将其传送到细胞中。这项技术来自加拿大温哥华英属哥伦比亚大学的一名生物化学家Pieter Cullis的实验室以及他创立或领导的几家公司（图5）。从20世纪90年代末开始，他们开创了LNPs，用于传递抑制基因活性的核酸链。其中一种名为patisiran的治疗方法已被批准用于治疗一种罕见的遗传病。在基因沉默疗法在临床试验中展示出希望之后，2012年Cullis的两家公司开始在基于mRNA药物中探索LNP传递系统。例如，由首席执行官Thomas·Madden领导的温哥华Acuitas Therapeutics公司，与宾夕法尼亚大学的Weissman集团和几家mRNA公司建立了合作关系，以测试不同的mRNA LNP配方,其中之一现在可以在BioNTech和CureVac的COVID-19疫苗中找到。Moderna的LNP混合物也没有什么不同。这些纳米粒子是四种脂肪分子的混合物，其中三种有助于结构和稳定性，第四种称为可电离的脂质的是LNP成功的关键。这种物质在实验室条件下是带正电的，这与Felgner和Malone在20世纪80年代后期开发的脂质体具有类似的优势。但是Cullis和他的商业伙伴提出的可电离的脂质在生理条件下，比如在血液中，会转换成中性电荷，这就限制了对身体的毒性作用。更重要的是，四脂能够允许产品储存更长时间，并保持其在体内的稳定性。Ian·MacLachlan说他曾在几家与cullis相关的企业担任高管，他说这是他们现在拥有的药理学的全部内容。到2000年代中期，一种混合和制造这些纳米颗粒的新方法被设计出来。它使用了T型接头装置，将溶解在酒精中的脂肪与溶解在酸性缓冲液中的核酸结合在一起。当两种溶液合并时，各组分自发形成了密集的LNPs。事实证明，这是一种比其他方法更可靠的技术。现在是圣地亚哥Replicate生物科学公司首席开发官的Andrew Geall形容说一旦所有的部分都凑在一起，就终于有了一个可以规模化的过程。2012年Geall领导了第一个将LNPs与RNA疫苗结合起来的团队。每个mRNA公司现在都使用这个LNP交付平台和制造系统的一些变体，不过谁拥有相关的专利仍然是法律纠纷的主题。目前，Moderna正在与总部位于温哥华的cullis旗下企业Arbutus Biopharma就COVID-19疫苗中发现的LNP技术的所有权问题展开激烈的竞争。

图5 Pieter Cullis 

行业诞生

到21世纪后期，已经有几家大型制药公司进入了mRNA领域。例如2008年，Novartis和Shire都建立了mRNA研究单位，前者(由Geall领导)专注于疫苗，后者(由Heartlein领导)专注于治疗。2012年，美国国防高级研究计划局决定开始资助行业研究人员研究RNA疫苗和药物，BioNTech就是在那一年成立的，此外这一决定推动了其他初创企业的加入。Moderna是在这项工作基础上发展起来的公司之一，到2015年该公司已经筹集了超过10亿美元的资金，并承诺能够利用mRNA诱导体内的细胞制造自己的药物，从而治疗蛋白质缺失或缺陷引起的疾病。当这个计划受挫时，由首席执行官Stéphane Bancel领导的Moderna选择优先考虑一个不那么宏大的目标也就是生产疫苗。最初，这让许多投资者和旁观者感到失望，因为疫苗平台似乎没有那么具有变革性，也没有那么有利可图。到2020年初，Moderna已经开发出9种可用于传染性疾病人体测试的mRNA候选疫苗。但是没有几个是非常成功的，其中只有一项进展到更大阶段的试验。但当新冠病毒爆发时，Moderna迅速采取了行动，在病毒基因组序列在网上公布后的几天内就研制出了原型疫苗。随后，该公司与美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)合作，在不到10周的时间里进行了小鼠研究和人体试验，生物科技公司也采取了全员参与的方式。2020年3月该公司与总部位于纽约的制药公司Pfizer合作，临床试验以创纪录的速度进展，在不到8个月的时间里，完成了从首次人体试验到紧急批准。有两种授权疫苗都使用LNPs中改良的mRNA，两者都含有编码SARSCoV-2刺突蛋白的序列，该蛋白的形状更易于诱导保护性免疫（图6）。许多专家表示，由NIAID疫苗学家Barney Graham、得克萨斯大学奥斯汀分校结构生物学家Jason McLellan和斯克里普斯大学的Andrew Ward设计的蛋白质调整也是一项值得称道的贡献，尽管这是针对冠状病毒疫苗的，而不是作为一般平台的mRNA疫苗。说到专利，会发现在关于mRNA发现的荣誉讨论中，一些争议与谁拥有利润丰厚的专利有关。但是，大部分基础性知识产权可以追溯到1989年Felgner、Malone和他们在Vical的同事提出的主张以及1990年Liljeström提出的主张。这些文件自发行之日起只有17年的期限，所以现在属于公共领域。即使是2006年Cellscript申请的Karikó、Weissman专利，也将在未来5年内到期。业内人士表示，尽管公司可以合理地为mRNA的特定序列(如刺突蛋白)或专有的脂质配方申请专利，这可能使在脂质纳米颗粒中传递mRNA的广泛要求变得困难。Moderna是mRNA疫苗领域的主导公司，该公司在流感、巨细胞病毒和其他一系列传染病的临床试验中进行了实验性注射。该公司去年获得了两项专利，都涉及mRNA用于生产分泌蛋白的广泛使用，但多位业内人士认为这可能会具有挑战性。位于加拿大卡尔加里的mRNA疫苗公司Providence Therapeutics的首席科学官Eric Marcusson说他们不认为有很多东西可以申请专利，当然也不可能强制执行。

图6 mRNA新冠疫苗 

诺奖争议

至于谁应该获得诺贝尔奖，最常被提及的名字是Karikó和Weissman。两人已经获得了科学领域最高奖金Breakthrough和西班牙著名的阿斯图里亚斯公主奖等多个奖项。获得阿斯图里亚斯奖的还有Felgner、Şahin、Türeci、Rossi，以及英国牛津大学开发的新冠疫苗的疫苗学家Sarah Gilbert和制药公司AstraZeneca。这个公司使用的不是mRNA，而是病毒载体。Cullis最近获得的唯一荣誉是由研究缓释药物的科学家组成的专业组织控释学会颁发的5000美元创始人奖。一些人还认为，Karikó对整个mRNA研究的贡献应该得到认可，就像她在实验室中的发现一样。英属哥伦比亚大学的RNA生物工程师Anna Blakney表示她不仅是一位了不起的科学家，而且是该领域的一支力量。Blakney对Karikó给予肯定也是因为他在两年前为她提供了一个重要会议的演讲机会，当时她还在一个初级博士后职位上。在整个职业生涯都不被认可的情况下，Karikó也在积极地帮助他人。虽然包括Malone在内的一些参与mRNA开发的人认为他们应该得到更多的认可，但其他人更愿意分享这种关注。Cullis说真的不能说自己有功劳。举个例子，当谈到他的脂质输送系统时，可以说是数百人，数千人一起工作来制造这些LNP系统，这样它们才能真正做好。Karikó说，每个人都在逐渐增加一些东西，包括他。回顾过去，许多人说他们只是很高兴，mRNA疫苗正在改变人类，他们可能在这条道路上做出了宝贵的贡献。Felgner说看到这样的场面，感到非常激动，所有当时认为会发生的事情现在都发生了。

这个故事到这里就结束了，可以从中了解到科学创新改变生活的过程可能包括了几十年的阻碍、否定和潜在利润的斗争，但更多的是慷慨、好奇和顽强的毅力，以对抗怀疑和不断探索的精神。正如亚利桑那大学的发育生物学家Paul Krieg所说的这是一个漫长的过程，你永远不知道哪些步骤会有用。小编觉得这可能也正是科研的魅力所在。

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