m6A甲基化是最近的热点，其最大的特点之一就是易于和自己的课题结合。这篇文章的亮点在于我第一次系统地研究了m6A甲基化和铁死亡的结合，并建立了较完善的研究方法，对大家的研究启发很大。甚至可以模仿或套用。 磨刀不误砍柴工，在进入正题之前一定要先看看m6A和铁死亡相关的基础知识。N6-甲基腺嘌呤(m6A）是真核生物最常见和最丰富的RNA分子修饰。从发育和代谢到生殖。m6A存在于很多物种质中，占到了RNA碱基甲基化修饰的80%。m6A主要分布在mRNA中，也出现在非编码RNA如tRNA， rRNA和snRNA。在转录成的RNA中相对高的m6A含量会影响RNA的代谢过程，比如剪切，核转运，翻译能力和稳定性，以及RNA转录。说的这么正式，我总结一下：m6A非常常见，你所研究的疾病或表型很有可能涉及。 M6A修饰是一个高度动态和可逆的过程，涉及到负责安装称为“Writers”的修饰、移除称为“Erasers”的甲基化和识别称为“Readers”的修饰的酶(图1)。每一类调节器的都可以发挥作用，以维持细胞内m6A水平的稳态平衡1。
Writers ：在RNA加上甲基，介导RNA的甲基化修饰过程。干这活的是甲基转移酶，最常见的分子是METTL3和METTL14，两者可在体外和体内催化mRNA（和其他细胞核RNA）的m6A甲基化。WTAP是这种甲基转移酶复合体中的另一个关键组分。 Erasers ：将RNA上甲基去除，介导RNA的去甲基化修饰过程。FTO和ALKBH5可以去除mRNA（和其他细胞核RNA）上的m6A甲基化。 Readers ：识别RNA甲基化修饰的信息，并参与下游RNA的翻译、降解等过程。比如，YTHDC1可与mRNA上的m6A修饰，促进mRNA出核运输与可变剪接。YTHDF1/YTHDF3识别m6A后可促进mRNA的翻译，而YTHDF2与m6A的结合则会促进mRNA的降解。 M6A-seq和MeRIP-seq测序方法建立于2012年。技术原理是使用特异性抗体富集m6A修饰的RNA片段，将mRNA随机片段化，进行高通量测序。MeRIP-Seq/m6A-seq 需要构建两个文库：MeRIP-Seq/m6A-seq文库（IP，免疫沉淀）和 RNA-seq文库（input，对照）。 其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m6A水平，在这里我自己的实验用的是比色法，我也更推荐比色法，虽然比色法与LC-MS/MS比较相似，也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取totAl RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。还有对应的试剂盒可以使用，其核心原理与ELISA反应类似，经过优化后检测m6A灵敏度也高。 还有一项必备的验证试验用来验证甲基化相关酶与关键基因结合：所谓m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR，即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后，下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。这种技术可以做到对发生甲基化的RNA进行相对定量，是一种低成本的检测方法，仅需m6A抗体，A/G免疫磁珠，磁力架和qPCR仪及配套试剂盒即可开展这类实验。
铁死亡（ferroptosis）是近年发现的一种新型细胞死亡方式，其特征是脂质过氧化物和活性氧(ROS)的过量蓄积。由于该过程依赖铁，所以被称为铁死亡。铁死亡不仅与众多疾病的发生发展有关，其相关信号通路上的关键蛋白也可成为药物的作用靶点。铁死亡的的本质是细胞内脂质氧化物的代谢障碍，进而在铁离子的催化下异常代谢，产生大量脂质，破坏细胞内氧化还原平衡，攻击生物大分子，触发细胞的死亡2。
上图看起来复杂，但是还是有思路可循，我把其思路进行梳理变化成相关的铁死亡的特点
根据这些铁死亡的特点，也就衍生出对应的研究工具出现 形态观察 ：透射电镜直接对细胞形态进行观察：细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大； 活性氧水平 ：细胞内活性氧和脂质活性氧通过流式细胞术使用DCFH-DA和C11-BODIPY 荧光探针（购买试剂盒）检测 铁水平检测 ：可以使用PGSK探针，流式细胞术或共聚焦显微镜检测细胞内铁含量的细胞膜透性染料；或者使用Iron AssAy Kit（试剂盒）检测细胞、组织中的铁水平 线粒体膜电位检测 ：通过流式细胞仪收集TMRE阳性细胞的比例 qRT-PCR/Western blot检测：检测细胞内与铁死亡相关的因子的变化，例如COX-2，ACSL4，PTGS2，NOX1，GPX4和FTH1等，其中COX-2，ACSL4，PTGS2和NOX1在铁死亡细胞中表达上调；GPX4和FTH1在铁死亡细胞中表达下调。 这次我主要给大家带来两个思路，这两个思路的特点是简单好上手换个疾病就是一篇SCI。 这里蛋和鸡自然指的就是m6A甲基化和铁死亡。第一种思路是先发现m6A甲基化再去联系铁死亡：m6A甲基化关键酶可以诱导铁死亡 首先我们得确定研究的疾病或者表型是否有m6A甲基化及其关键酶差异表达。举个例子：在这里作者3的结果表明，BPQD暴露（处理组）增加了肺细胞中整体RNA m6A的水平，这可能与去甲基酶ALKBH5的下调有关。
这步就是具体研究哪些甲基化相关酶发生变化，有没有具体的位点。
图2.处理措施对肺细胞RNA m6A表位转录组的影响 这些结果表明，RNA m6A表位转录组确实受到处理方式对肺细胞的生物学影响。并且这种影响很有可能和众所周知，脂氧合酶途径、对硒离子的反应以及脂肪酸代谢过程密切相关。铁死亡是一种新的调节细胞死亡的形式。它通常是由严重的脂质过氧化、谷胱甘肽(GSH)耗竭和铁超载引起。在死亡细胞中，线粒体的形态发生了很大的变化，包括体积变小，嵴减少，膜浓缩，外膜破坏。在这里，作者通过外转录和转录分析发现处理方式可能引发肺细胞的铁死亡。
接下来作者继续探索机制和下游的影响这是文章深度的关键！ALKBH5基因敲除增加m6A并加重处理诱导的铁死亡。这些结果表明，处理组通过抑制ALKBH5的表达而引发肺细胞铁死亡。 图4.ALKBH5基因敲除增加了全局m6A，加重了BPQD诱导的铁死亡
无独有偶，在另一篇文章4中作者也发现YTHDC2诱导了LUAD细胞内源性铁死亡。 在这里作者选用了过表达m6A甲基化关键酶阅读器YTHDC2，作者在这里一定是做了相关的预实验，才精准的确定了YTHDC2的作用，我个人更倾向于于用生信的方法去筛选，不仅可以提升文章的档次，还可以增加成功的概率。作者发现YTHDC2在H1299和H1975细胞中不受经典铁死亡诱导剂和抑制剂如erAstin、RSL3、Fer-1和DFO的影响，表明YTHDC2是一种独立的内源性体外死亡诱导剂，发挥着经典铁死亡诱导剂或抑制剂不可替代的作用。 图5.YTHDC2是一种内源性铁死亡诱导剂
有没有感觉到很熟悉，相似的思路和套路。不仅如此还可以进阶做一些机制实验。比如：线粒体和抗氧化基因mRNAs的m6A修饰被YTHDF2识别。还可以分别从MeRIPseq和RNA-seq的数据中对差异m6A峰与其相应基因的表达水平进行了关联分析。根据RNA-seq分析YTHDF2在许多类型的细胞或组织中负责调节mRNA的翻译、衰变和清除。然后，还可以用RNA免疫沉淀(RIP)qPCR方法检测了YTHDF2的候选靶向mRNA及其在处理后的变化。
图6 处理组通过YTHDF2识别和衰退减少肺细胞中抗铁死亡相关基因的表达 这样就进一步增加了机制的研究文章的档次也就上去了。 第一种思路是先通过m6A甲基化来与铁死亡相关联，第二种思路5自然是先有铁死亡再有m6A甲基化。临床前和临床药物(如索拉非尼和Erastin)可以诱导HSC铁死亡。m6A修饰是否参与HSC铁死亡的调节？为了测试这种潜在的可能性。 作者首先检测了HSC铁死亡期间m6A的修饰水平。 引人注目的是，m6A rnA甲基化定量分析和斑点印迹显示，索拉非尼、erastin和RSL3治疗后m6A修饰水平显著增加。接下来就是苦力活了，验证几种甲基化的关键酶，因为这个时候已经证明了甲基化的变化。在HSC铁死亡中，METTL4而不是其他甲基转移酶的蛋白导致mRNA的表达显著上调，而FTO而不是其他去甲基化酶的水平显著下调。这些结果表明，HSC铁死亡时m6A的修饰增加是由于Writers METTL4和Erasers FTO的失调所致。
由于所以利用稳定转染METTL4 shRNA或FTO质粒的HSC-Lx2细胞，研究上调的m6A修饰是否直接参与了铁死亡的诱导。经费不足可选择一个做就可里啦。m6A RNA甲基化定量分析证实，METTL4基因敲除和FTO过表达均可完全减弱Erastin诱导的HSC-Lx2细胞m6A修饰上调此外，METTL4 shRNA或FTO质粒可显著解除Erastin和索拉非尼对HSC-Lx2和HSC-T6细胞的生长抑制。总体而言，这些数据表明，铁死亡诱导治疗上调m6A修饰可能有助于HSC铁死亡。说到底就是验证试验，当然这步也是必不可少的。
但是这样还达不到一定的深度，到不了5+。因为机制还差了点，那就是m6A修饰是通过那些途径引导铁死亡的？总不能一个一个猜吧。这个时候筛基因当然有请进一步的RNA测序(RNA-seq)，进一步探讨m6A修饰促进HSC铁死亡的分子机制，并确定参与谷氨酰胺代谢途径、非经典自噬途径和经典铁代谢途径的靶基因。重要的是，KEGG的分析和GO分析充分表明，在HSC铁死亡过程中，自噬信号可能受到m6A修饰的调节。此外，m6A RNA免疫沉淀(MERIP)qPCR显示，HSC铁死亡患者BECN1的m6A修饰水平增加，而ATG3、ATG4A、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG12和ATG16L1的m6A修饰水平无明显变化。一致地，用FTO质粒或METTL4 shRNA减少m6A修饰后，BECN1的蛋白表达显著降低，而其他自噬相关基因没有明显差异。总之，这些数据表明，m6A修饰诱导的铁死亡与自噬激活有关。做到这些已经可以轻松驾驭5+了~
以上，大家是否感觉m6A结合铁死亡这种强强联合的文章也不是很难呢？这篇文章的亮点在于我第一次系统地研究了m6A甲基化和铁死亡的结合，并建立了较完善的研究方法，对大家的研究启发很大。做基础研究的的基本思路之一就是发现某种现象、表型等，然后分析探讨其背后的原因。一件复杂的事物中往往蕴含着简单规律，无论是学习科研还是做科研也都是有规律可循。今天我借借用几篇文章一窥普通科研思路套路的升华过程。 正如我开头所说因为m6A会涉及大多数疾病和表型，所以不用太担心你研究的内容没有m6A修饰。并且根据我的检索这类文章非常少，你还不抓紧时间上车~ 1. Uddin MB, Wang Z, Yang C. The m(6)A RNA methylation regulates oncogenic signaling pathways driving cell malignant transformation and carcinogenesis. Mol Cancer 2021; 20(1): 61. 2. Jiang X, Stockwell BR, Conrad M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol 2021; 22(4): 266-82. 3. Ruan F, Zeng J, Yin H, et al. RNA m6A Modification Alteration by Black Phosphorus Quantum Dots Regulates Cell Ferroptosis: Implications for Nanotoxicological Assessment. Small Methods 2021; 5(3): e2001045. 4. Ma L, Zhang X, Yu K, et al. Targeting SLC3A2 subunit of system XC(-) is essential for m(6)A reader YTHDC2 to be an endogenous ferroptosis inducer in lung adenocarcinoma. Free Radic Biol Med 2021; 168: 25-43. 5. Shen M, Li Y, Wang Y, et al. N(6)-methyladenosine modification regulates ferroptosis through autophagy signaling pathway in hepatic stellate cells. Redox Biol 2021; 47: 102151.