单细胞测序中的“湿”实验

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我们先回顾一下以前的高通量测序类的文章，当某项测序技术刚刚兴起的时候，单纯的生信分析就可以发比较好的期刊，最大的原因就是技术和创意新颖。但随着技术的发展，价格的下降，这些文章越来越多。于是审稿人就要求测序类文章要加以基础实验验证。尤其是高分测序文章，甚至用体内动物实验（in vivo）和体外细胞实验（in vitro）来升华自己的文章。但是对于单细胞测序而言，其技术角度和常规的测序文章明显不同。我们会感觉单细胞测序类文章会有大量生信分析的部分。但是这类文章还是会穿插一些基础实验来提升文章的档次。在小编看过了许多篇关于单细胞测序的文章后，为大家总结出单细胞测序中的“湿”实验。下面我就为大家具体介绍下这类实验~

一、流式技术

同样，流式细胞仪（flow cytometry，FCM）也是作为一种强大的单细胞分析工具。流式细胞术是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。

其主要的流程如下：

• 制备单细胞悬液并荧光染料标记抗体进行染色。
• 收集单细胞上的荧光信号。
• 利用荧光信号的强度统计细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度。
• 根据所测定的参数做细胞分选。

举个栗子：

在下面的这篇文章中[1]，作者建立了非肥胖糖尿病(NOD)自身免疫小鼠模型，并在4、8、15周取小鼠胰岛组织做了单细胞测序。在这3个时间点，作者发现胰岛内浸润的细胞主要是T细胞、B细胞和cDCs。流式细胞术证实了胰岛内主要细胞群的存在，并且sc-RNA seq鉴定的浸润模式涵盖了了流式细胞术的数据。

二、免疫荧光技术

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。这使得组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

一般的流程如下：

举个栗子：

在下面的这篇文章[2]中，作者发现胃粘液分泌细胞主要主要由表达MUC5AC的PMCs（pit mucous cell）和表达MUC6的GMCs（gland mucous cell）组成。利用PCA（主成分分析）发现这些表达MUC6的腺细胞明显分为两个亚群。簇1的表达特征符合正常胃窦腺细胞的分子特征，但是簇2的表达特征主要由肠干细胞或发育相关基因组成，包括OLFM4、PHLDA1和LEFTY1。所以作者用免疫荧光(IF)染色证实了MUC6和OLFM4以及LEFTY1是共同表达的（获得肠干细胞表型）。

三、免疫组化

免疫组化，免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)，也是是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。

免疫组化流程如下：

举个栗子：

在下面的这篇文章[3]中，作者通过对EOC（上皮卵巢癌）患者卵巢组织单细胞测序内容的分析确定了肿瘤细胞内两个亚群的生物标志物后（CYR61/RGS5），作者在8个卵巢癌样本中应用了CYR61和RGS5的IHC共染色，以验证样品制备和scRNA-seq的生信分析的可靠性。IHC结果证明，CYR61+肿瘤细胞和RGS5+CAFs的比例与scRNA-seq结果是一致的。

大家有没有觉得很熟悉？免疫组化和免疫荧光有点相似。下面我为大家总结一下两者的异同点。方便大家选择 。

相同点：

两者都是利用抗原抗体结合原理在蛋白层面进行研究。

不同点：

1、标本制作：免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，所以石蜡切片仍然是免疫组化首选的标本制作方法。

2、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。3、标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。

4、结果展示：免疫荧光得到的图片是彩色的，上档次。免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。

四、免疫印迹

Western Blot蛋白免疫印迹是对目的蛋白进行检测、分析以及定量的一种技术。蛋白质样品经SDS-PAGE 分离后从凝胶转移到固相支持物（如PVDF膜）上，后用特异性抗体对某一特定的抗原进行着色，分析着色的位置或深度获得该蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。其可以说是检测蛋白质的金标准（受到审稿人青睐）。下面是WB的一般流程:

举个栗子：

在下面这篇文章[4]，作者对从健康和NASH（非酒精性脂肪肝）小鼠肝脏分离的非实质细胞进行单细胞RNA测序。通过一系列分析工作，作者为代谢组织中的非实质细胞类型在代谢控制和疾病进展中发挥更普遍的作用。其中如下图所示，作者就利用WB技术证明了在喂食CDAHFD（高脂饮食）的小鼠中，服用Elafibror后，肝脏GPNMB蛋白表达和血浆GPNMB水平也一直降低。

五、RNA-FISH

FISH当然不的鱼的意思，FISH是指荧光原位杂交技术(Fluorescene in situ hybridization, FISH)的缩写。FISH是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。是利用DNA碱基互补配对的特点，在体外一定的条件下，使同源的DNA链或DNA-RNA单链结合成双链，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。

下面分享下RNA-FISH心得体会

• 前期标本制备和蛋白酶K的作用浓度：蛋白酶K浓度影响细胞核形态，造成模糊不清，浓度低了则探针不易进入细胞核，杂交率大大降低。
• 探针标记：就是一句话--买好点的。
• 杂交：这步的动作要领是轻柔地按一点。另外我师兄告诫我：在封片时，一定要密封好玻片，可以采用凝胶类的物质封住四                周。杂交条件：孵育时间一般20h左右。温度要严格控制在36-40℃之间，过高或者过低都是不适合的。
• 显带：感觉没啥要注意的细节~
• 显微镜观察：封片后标本要尽快检测和观察。每一次荧光显微镜的观察都会淬灭一部分信号，因此一定要快速观察和采集图像。

举个栗子：

在下面这篇文章[5]中，作者分析了两个果蝇的睾丸单细胞RNA序列(scRNA-seq)数据。作者发现有证据表明，X染色体在体细胞和减数分裂前细胞中的转录活性与常染色体相同，而在减数分裂和减数分裂后细胞中的转录活性低于常染色体。通过scRNAseq和RNA-FISH，作者发现大多数msl（male-specific lethal）基因MLE、roX1和roX2的胚系表达水平很低或检测不到，没有胚系核roX1/2定位的证据。scRNAseq和RNA-FISH的结果相似互相印证。

六、谱系示踪技术

这个技术相对来讲就复杂了点。首先多细胞生物的生长发育基于细胞分裂和分化。在哺乳动物的胚胎发育早期阶段，每个细胞就已经被赋予了特定的分化潜能( cell totipotency)，这种特性在后期发育过程中才逐渐表现出来，最终分成为不同的组织、器官类型。另外一方面，某些终末分化的成体细胞在一定的生理或者病理条件下会发生去分化( dedifferentiation)或者转分化 ( transdifferentiation)，变为另外一种细胞或组织类型，例如肿瘤的发生、心脏成纤维细胞再编程转分化为心肌细胞等现象。细胞的命运决定是指单个细胞及其所有后代细胞的分化和发育活动，对细胞的命运决定进行追踪和观察称为细胞谱系示踪。

以Cre-loxP 同源重组系统为例介绍一下大概流程：

在含有 Cre 的转基因小鼠中，Cre 在特性基因的启动子驱动下，在特定的细胞类群中表达，当 Cre 小鼠与含有 loxP 位点的报告基因小鼠交配后，Cre 通过识别 loxP位点，将两个 loxP 位点之间的终止序列切除，从而使含有 Cre 的细胞类群表达出报告基因，由于这种切除是位于基因上的，从而是永久性的和不可逆的，因此，所有表达 Cre 的细胞类群及其后代都将永久的被报告基因蛋白标记上，因此，利用该细胞追踪技术可以解析特定细胞的起源和命运。

举个栗子：

在下面这篇文章[6]中，作者通过遗传谱系追踪和单细胞RNA测序，发现Lepr-Cre标记了成年鼠长骨中大部分的骨髓基质细胞和成骨细胞。瘦素受体(Lepr)阳性细胞是骨髓造血微环境的重要组成部分，高度富集在骨骼干/祖细胞，可以维持成人骨骼内环境的稳定。然而，这个群体中的异质性一直难以捉摸。Lepr-Cre示踪细胞在稳态和应激条件下的综合分析揭示了成脂、成骨和骨膜谱系的动态变化。通过对8周龄Lepr-Cre小鼠股骨远端的免疫荧光显像（骨折前后）。作者发现虽然在骨折前仅能检测到少量Lepr-Cre+骨膜细胞，但骨折和照射后骨膜细胞明显扩张。

小编总结：

介绍了那么多实验，但是具体该选择哪一种实验还要结合实验内容，实验周期，实验费用来确定。但是有验证实验的话绝对可以提升文章的档次！好了，今天关于单细胞测序中的“湿”实验方法就列举到这里，如果你在单细胞测序文章中还发现其他的“湿”实验，可以留言供大家一起学习~~

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参考文献

[1] P.N. Zakharov, H. Hu, X. Wan, E.R. Unanue, Single-cell RNA sequencing of murine islets shows high cellular complexity at all stages of autoimmune diabetes, J Exp Med, 217 (2020).

[2] P. Zhang, M. Yang, Y. Zhang, S. Xiao, X. Lai, A. Tan, S. Du, S. Li, Dissecting the Single-Cell Transcriptome Network Underlying Gastric Premalignant Lesions and Early Gastric Cancer, Cell Rep, 27 (2019) 1934-1947 e1935.

[3] T. Kan, S. Zhang, S. Zhou, Y. Zhang, Y. Zhao, Y. Gao, T. Zhang, F. Gao, X. Wang, L. Zhao, M. Yang, Single-cell RNA-seq recognized the initiator of epithelial ovarian cancer recurrence, Oncogene, DOI 10.1038/s41388-021-02139-z(2022).

[4] X. Xiong, H. Kuang, S. Ansari, T. Liu, J. Gong, S. Wang, X.Y. Zhao, Y. Ji, C. Li, L. Guo, L. Zhou, Z. Chen, P. Leon-Mimila, M.T. Chung, K. Kurabayashi, J. Opp, F. Campos-Perez, H. Villamil-Ramirez, S. Canizales-Quinteros, R. Lyons, C.N. Lumeng, B. Zhou, L. Qi, A. Huertas-Vazquez, A.J. Lusis, X.Z.S. Xu, S. Li, Y. Yu, J.Z. Li, J.D. Lin, Landscape of Intercellular Crosstalk in Healthy and NASH Liver Revealed by Single-Cell Secretome Gene Analysis, Mol Cell, 75 (2019) 644-660 e645.

[5] E. Witt, Z. Shao, C. Hu, H.M. Krause, L. Zhao, Single-cell RNA-sequencing reveals pre-meiotic X-chromosome dosage compensation in Drosophila testis, PLoS Genet, 17 (2021) e1009728.

[6] C. Mo, J. Guo, J. Qin, X. Zhang, Y. Sun, H. Wei, D. Cao, Y. Zhang, C. Zhao, Y. Xiong, Y. Zhang, Y. Sun, L. Shen, R. Yue, Single-cell transcriptomics of LepR-positive skeletal cells reveals heterogeneous stress-dependent stem and progenitor pools, EMBO J, DOI 10.15252/embj.2021108415(2021) e108415.