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文章摘要

本研究旨在探讨成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）及其衰老在骨关节炎（OA）进展中的作用和调节机制。在患者和小鼠模型中，随着OA的进展，衰老的FLSs显著增加。作者确定OA-FLS中发生自噬受损，导致衰老相关分泌表型（SASP）上调，自噬的重建通过抑制GATA4逆转衰老表型。此外，作者首次观察到过度m6A修饰对OA-FLS中的自噬产生负性调节。该研究揭示了FLS衰老在OA进展中的重要作用。在实验动物模型中，靶向METTL3抑制可以缓解FLS的衰老，限制OA的发展，为OA治疗提供了一种潜在的策略。

嗨，早上好呀，相信经过持续关注，大家已经对细胞衰老有所了解。今天给大家分享一篇2022年1月份发表在风湿病Top级别期刊的文章，Ann Rheum Dis（Q1，IF=19.103）。

METTL3介导的ATG7 m6A修饰调节自噬-GATA4轴促进细胞衰老和骨关节炎进展

背景

骨关节炎（OA）是晚年最常见的关节疾病，其主要特征是软骨基质逐渐丧失，并伴有其他关节成分的病理变化，包括软骨下骨硬化和滑膜炎症。据报道，偶发症状性膝关节骨性关节炎在55至64岁之间达到高峰。在老年人中，多种与衰老相关的因素可能有助于OA的发展。线粒体功能障碍、氧化应激和自噬减少改变软骨细胞功能，促进分解代谢过程和合成代谢过程中的细胞死亡。因此，提高对衰老如何促进OA进展的理解，将为减缓或停止OA提供新的策略。衰老细胞的长期存在与组织功能丧失和OA等与年龄相关的慢性疾病密切相关。细胞衰老是衰老的重要标志，软骨细胞在衰老和OA进展过程中具有衰老细胞的各种特征。据报道，在OA的发病机制中，大量滑膜细胞衰老。关节软骨细胞依赖自噬作为维持正常功能和存活的主要机制。在衰老过程中，软骨细胞中的自噬逐渐减少，从而导致衰老，最终导致OA严重程度加重。然而，OA进展中自噬受损的机制尚不清楚。

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N6-甲基腺苷（m6A）作为一种广泛的RNA转录后修饰，决定信使RNA（mRNA）的稳定性、剪接、运输、定位和翻译效率，深入参与各种细胞过程，包括DNA损伤、自噬和细胞衰老。最近，有报道称，m6A甲基转移酶的核心成分甲基转移酶样3（METTL3）在人类类风湿性关节炎滑膜中显著升高。METTL3基因敲低可有效抑制成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中的炎症和MMP因子表达。然而，m6A修饰的生物学意义以及FLS细胞衰老的潜在调节机制仍不完全清楚。

一句话总结现状：衰老细胞的长期存在与骨关节炎（OA）的发展密切相关，但潜在的机制仍不清楚。

在这项研究中，作者首次在体外和体内证明了衰老FLS在OA进展中的关键作用，并发现m6A修饰与FLS衰老之间存在正相关。METTL3以m6A-YTHDF2依赖的方式影响自噬相关7（ATG7）mRNA的稳定性，从而影响自噬活性，进而促进FLS衰老和OA进展。

材料方法

作者收集正常和OA患者的滑膜组织，通过免疫荧光和免疫印迹分析滑膜FLS的衰老；通过N6-甲基腺苷（m6A）-甲基化RNA和RNA免疫沉淀分析，探讨了甲基转移酶样3（METTL3）在自噬调节中的作用；对进行内侧半月板（DMM）手术的小鼠进行关节内注射pAAV9（含有靶向METTL3的小干扰RNA（siRNA））或不注射pAAV9，进行组织学分析以确定软骨损伤。

结果

FLS衰老和自噬受损与OA的进展密切相关

为了探索细胞衰老在OA发展中的作用，作者首先检测了人类OA患者滑膜组织中衰老细胞的典型生物标记物p16INK4a和p21的表达。OA患者滑膜中二者的蛋白质和mRNA水平显著升高（图1A-D）。作者进一步观察了OA滑膜组织中衰老FLS的积累和表型特征，p16INK4a和FLS标记物波形蛋白的双阳性免疫染色证实了这一点（图1E）。OA患者滑膜中自噬小泡的积聚减少，表明OA滑膜中自噬不足（图1F）。通过DMM建立了创伤后OA模型，作者发现与假手术小鼠相比，DMM小鼠滑膜中p16INK4a阳性FLS的数量以时间依赖性的方式显著增加（图1G）。软骨降解和OARSI（Osteoarthritis Research Society International）评分随时间显著加重（图1H），这与增强的FLS衰老密切相关（图1I）。此外，作者还证明，在DMM诱导的OA进展过程中，LC3B的表达显著降低（图1J），这与OARSI评分呈负相关（图1K）。这些结果表明FLS衰老和自噬受损与OA进展密切相关。

图1 FLS衰老和自噬受损与OA的进展密切相关

衰老的FLS有助于软骨细胞在体内和体外的分解代谢作用

为了进一步验证衰老的FLS是否能加速OA的病理进展，作者将人类软骨细胞（C28/I2细胞）与OA患者的原代FLS（OA-FLS）或非OA患者的FLS（Con-FLS，图2A）共同培养。有趣的是，在与OA-FLS共培养后，检测到C28/I2细胞中MMP13和ADAMTS5的表达增加，II型胶原的表达减少（图2B，C）。此外，为了进一步研究衰老的FLS对体内软骨降解的影响，作者使用博莱霉素（一种DNA损伤化学剂）诱导小鼠FLS中的细胞衰老，然后未经DMM手术的小鼠关节内注射2.5×105正常FLSs或博莱霉素诱导的衰老FLSs（图2D）。在第一次注射后第56天，作者发现注射衰老FLSs的小鼠与注射正常FLSs的小鼠相比，safranin O染色减少，II型胶原表达降低（图2E，F），同时滑膜和软骨中p16INK4a表达升高（图2G，H）。这表明外源性注射衰老的FLS可引发软骨功能障碍，并诱导滑膜和软骨衰老。

图2衰老FLS在体外和体内促进软骨降解

OA患者和DMM诱导的OA小鼠的衰老FLS中的自噬受损

在OA和DMM小鼠模型患者中，FLSs中LC3B表达降低（图3A、B）。p16INK4a阳性细胞中的LC3B显著降低（图3C、D）。为了证实OA-FLS中自噬结构的减少是由自噬损伤还是自噬降解增强引起的，作者使用了自噬通量抑制剂巴非霉素，它可以通过防止溶酶体降解增加LC3B。巴非霉素处理增加了Con FLS中LC3B点状细胞的数量，并提高了p62的水平。然而，巴非霉素治疗并没有增加OA-FLS中LC3B和p62的表达（图3E，F），这表明OA-FLS缺乏进一步自噬体形成的能力，并且OA-FLS中溶酶体的降解能力已经处于较低水平。

图3 OA患者和DMM诱导的OA小鼠的FLS中自噬受损

FLS中受损的自噬以GATA4依赖性方式加速细胞衰老

为了评估自噬是否介导FLS衰老，作者进行了额外的自噬激活和阻断实验。一方面，雷帕霉素激活自噬有效增加了每个细胞的LC3B-II和LC3点状蛋白质水平，并抑制了一系列事件，包括p16INK4a、p21和p62的表达（图4A）。另一方面，通过3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬可显著降低LC3B-II水平，并伴有Con-FLS中p62、p16INK4a和p21的表达升高（图4B）。衰老调节剂GATA4在体内和体外OA-FLS中显著增加（图4C、D）。此外，在OA-FLS中通过雷帕霉素恢复自噬可有效降低GATA4的表达，而3-MA治疗显著提高Con-FLS中GATA4的蛋白水平（图4A，B）。GATA4基因敲低减轻了3-MA诱导的p16INK4a、p21和SASP的表达（图4E、F）。相反，GATA4的上调可能有助于p16INK4a、p21和SASP的表达（图4G，H）。

图4自噬以GATA4依赖性方式调节细胞衰老

升高的m6A水平与OA-FLS中的自噬受损相关

为了确定m6A修饰是否参与调节OA发展过程中FLS中的自噬活性，使用免疫荧光法测定m6A的水平。在OA患者和DMM小鼠模型的FLS中，m6A表达均显著增加（图5A-C）。鉴于m6A修饰主要受m6A甲基转移酶复合物的调节，作者测量了OA滑膜和OA-FLSs中相关复合物的mRNA水平，除了METTL3的mRNA表达显著上调，而其他基因的mRNA表达没有显著变化。从OA患者滑膜分离的FLS中METTL3的蛋白质水平也显著升高（图5D，E）。通过对人类OA滑膜和DMM诱导的OA模型中使用免疫荧光染色对波形蛋白和METTL3进行双重标记，进一步证实了这一发现（图5F，G）。METTL3的上调提高了m6A水平，伴随着LC3B-II的表达降低，p62和GATA4的表达增强（图5H）。相反，METTL3基因敲低降低了OA-FLS中m6A的水平，上调了LC3B-II的表达，并抑制了p62和GATA4的蛋白水平（图5I）。这些结果表明，METTL3介导的m6A修饰在FLS中自噬调节的衰老中起关键作用。

图5 m6A水平升高导致OA-FLS中的自噬受损

METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式诱导ATG7转录本的衰变

在人类OA-FLSs和DMM小鼠模型中，ATG7蛋白水平持续显著降低（图6A，B）。METTL3的上调显著降低了ATG7的表达（图6C）。相比之下，METTL3基因敲低上调了OA-FLS中ATG7的表达（图6D）。ATG7的上调有效缓解了METTL3诱导的LC3B-II减少，并降低了Con-FLS中p62和GATA4的表达（图6E）。ATG7的敲低也抑制了METTL3敲低诱导的LC3B-II增加，并提高了Con FLS中p62和GATA4的水平（图6F），表明METTL3诱导的FLS自噬缺陷是通过抑制ATG7介导的。接下来，作者对ATG7转录本进行序列分析，发现编码序列区内有三个m6A修饰位点，3′-非翻译区（UTR）内有五个m6A修饰位点（图6G）。m6A RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，m6A在位点1、2、4、5和7处显著富集（图6H）。与Con-FLS相比，OA-FLS中位点4和7的m6A富集显著增加（图6I），METTL3敲除后m6A富集显著减少（图6J）。这些结果表明METTL3靶向ATG7转录本，并以m6A依赖的方式调节ATG7。据报道，YTHDF1促进靶向m6A修饰mRNA的翻译，而YTHDF2选择性识别并破坏m6A修饰mRNA的稳定性。作者发现，YTHDF2基因的敲低显著减轻了METTL3诱导的ATG7蛋白表达的降低，而并不影响ATG7蛋白的表达。这表明METTL3修饰ATG7的m6A mRNA是YTHDF2的靶点（图6K）。此外，TG7与YTHDF2相互作用，但与YTHDF1无关（图6L，M）。上述结果表明METTL3以YTHDF2依赖的方式调节ATG7的表达。

图6 METTL3介导的m6A修饰以YTHDF2依赖性方式诱导ATG7转录本衰变

METTL3在体外调节细胞衰老和SASP表达

作者通过转染METTL3质粒在人类FLS中过度表达METTL3，METTL3的上调显著提高了人类FLS中p16INK4a和p21的表达（图7A，B）和SASP的mRNA水平（图7B）。β-半乳糖苷酶分析也证实METTL3促进FLSs的衰老（图7C）。而METTL3基因敲低明显抑制了OA-FLS中p16INK4a和p21的表达（图7D，E），并降低了SASP的表达和IL-1β的分泌（图7E）。另外，METTL3基因敲低可有效缓解博莱霉素诱导的小鼠FLS中p16INK4a、p21和SASP的表达（图7F），以及β-半乳糖苷酶的产生（图7G，H）。总之，这些数据表明METTL3可能作为一个潜在的治疗靶点来损害FLS的细胞衰老。

图7 METTL3在体外调节FLS中的细胞衰老和SASP表达

滑膜靶向METTL3抑制缓解了DMM小鼠模型中OA的进展

作者将编码滑膜成纤维细胞靶向肽基序（HAP-1）的DNA序列插入VP2结构域的N-末端，以构建FLS靶向的腺相关病毒载体（rAAV9.HAP-1）（图8A）。与rAAV9相比，rAAV9.HAP-1的转染效率略有提高，在ATDC5细胞中检测到低增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达（图8B，C）。关节内注射AAV9.HAP-1-si-METTL3后，DMM小鼠在OA发育过程中进行性软骨降解显著逆转（图8D，E）。此外，与用AAV9.HAP-1-NC治疗的小鼠相比，用AAV9.HAP-1-si-METTL3治疗的小鼠滑膜中的METTL3和p16INK4a水平显着降低（图8F）。这些结果表明，通过向滑膜的AAV9.HAP-1衣壳传递si-METTL3可以抵消DMM诱导的OA小鼠模型中的OA进展。

图8滑膜靶向抑制METTL3可减轻DMM诱导的OA的病理进展

总结

本文的研究结果扩大了对METTL3在促进细胞衰老和OA进展中发挥基础作用的机制的认识。METTL3通过调节自噬并以m6A-YTHDF2依赖的方式影响ATG7转录本的稳定性来实现这些功能（图8G）。该研究强调了m6A甲基化机制在自噬中的功能重要性，这为了解METTL3调节细胞衰老的潜在分子机制以及OA治疗策略的发展提供了见解。

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写在最后

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