免疫治疗相关的又一重大发现：隐形肽

大家好！今天跟大家分享的文献是2022年2月发表在Cancer Immunology, Immunotherapy（2021年IF=6.968）杂志上的一篇文章。文中涉及三个研究队列， 中山医院基层浸润膀胱癌患者队列、TCGA膀胱癌队列和IMvigor210 trial中接受PDL1治疗的膀胱癌患者队列进行研究，鉴定到潜在相关肽(Latency-associated peptide, LAP)也成为隐形肽的表达水平与膀胱癌患者的预后有关，可以作为一种潜在的治疗靶点。

图1 Cancer Immunology, Immunotherapy

背景介绍：

转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β)是属于一组调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。这一家族除TGF-β外，还有活化素（activins)、抑制素（inhibins)、缪勒氏管抑制质（Mullerian inhibitor substance, MIS)和骨形成蛋白（bone morpho-genetic proteins, BMPs）。

TGF-β的活化过程是其发挥正常功能的关键步骤，是一个受多种因素影响的复杂过程。TGF-β的活化在细胞外完成，是受多种因素影响的复杂过程。在胞内，TGF-β的各种异构体都是由各个独立基因产生的，先是被合成前体蛋白，然后在内肽酶、Furin 酶作用下产生TGF-β蛋白N端的二聚体潜在相关肽（Latency-associated peptide, LAP）和C端的二聚体成熟型TGF-β，这两部分以非共价形式相连，即TGF-β与LAP的复合物，它不具有生物活性[1]。LAP上的半胱氨酸富集区能够结合TGF-β功能区，并且LAP上具有结合潜在TGF-β 结合蛋白和整合素的识别区域[2]，TGF-β与LAP的复合物被分泌到细胞外后，经过复杂的过程，并在TGF-β 结合蛋白、整合素、BMP、活性氧等的作用下，LAP被祛除或发生构型改变，导致复合物瓦解，方可释放具有生物活性的TGF-β，TGF-β通过与细胞膜表面特异性受体结合才能发挥生物学效应[3]。

流程图

结果

1. 瘤内LAP表达预示MIBC患者预后不良

作者首先研究了中山医院膀胱癌队列癌组织中LAP表达的临床意义。高LAP +细胞浸润患者的预后明显较差(OS: P = 0.001, RFS: P ＜0.001;图1a)， TCGA膀胱癌队列的结果一致(图1b)。此外，多因素cox分析显示，癌组织LAP阳性和TGFB1阳性是膀胱癌患者OS的独立预后指标(图1c、d)和RFS (图1c、d)在两个队列中。因此，癌组织LAP阳性预示膀胱癌患者预后不良。

图1 Intratumoral LAP expression predicts dismal prognosis in MIBC patients.

2. 癌组织LAP阳性表明MIBC患者对铂类辅助化疗的反应减弱

进一步研究癌组织LAP 阳性和铂类辅助化疗反应之间的相互关系。我们发现，铂类辅助化疗对低表达LAP的膀胱癌患者具有显著的生存益处(图2b)，而对所有患者(图2a)和高表达LAP 的患者(图2c)， 铂类辅助化疗没有显示生存益处。

同时，单因素分析也证实铂类辅助化疗仅能低表达LAP膀胱癌患者的OS (图2d)和RFS (图2d)。亚组分析显示，低表达LAP的膀胱癌患者预后较好(图2 d)。因此，这些结果表明，低表达LAP 的膀胱癌患者更有可能受益于铂类辅助化疗。

图2 Intratumoral LAP expression indicates attenuated responsiveness to adjuvant chemotherapy in MIBC patients.

3.瘤内LAP表达与MIBC中CD8 + T细胞的免疫逃逸环境和功能障碍相关

为了探讨基于LAP表达可以对膀胱癌患者的预后进行分层潜在机制，作者接下来进行了CIBERSORT计算TCGA膀胱癌队列中低表达TGFβ的病人和高表达TGFβ的病人癌组织免疫细胞浸润水平。结果显示，高表达TGFβ患者促肿瘤细胞，包括M2巨噬细胞和中性粒细胞(图3a)。但是，抗肿瘤的CD8+T细胞浸润水平也较高。为了验证TCGA队列的结果，作者对中山医院收治的膀胱癌患者的组织样本进行免疫组化染色，以检测各种肿瘤浸润免疫细胞的水平。和TCGA结果一致，在TGFβ高表达亚组中发现了以M2巨噬细胞、中性粒细胞和CD8 + T细胞浸润升高为特征的免疫抑制TME(图3b)。

图3 Intratumoral LAP expression associated with an immunoevasive contexture with dysfunctional CD8 + T cells in MIBC. 

由于CD8 +细胞浸润增加与高表达LAP/TGFβ的患者生存差相矛盾，我作者接下来探讨了LAP/TGFβ高表达亚群中CD8 + T细胞的功能状态。经典的免疫检查点,如CTLA-4 PD-1 PDL1, 在TGFβ 高表达组的表达水平高于低表达组 (图3 c和d)。GSEA富集分析提示耗竭表型的CD8 + T细胞基因集在TGFβ上调 (图3 e)。在作者之前的研究中，使用16个新鲜切除的肌层浸润膀胱癌患者的组织进行流式细胞术来研究TME的CD8 +细胞功能和免疫抑制功能。本研究中作者重新分析以往研究的数据，确认LAP +细胞和CD8 + T细胞衰竭之间的关系(图3f)。我们观察了高LAP +细胞亚群中CD8 + T细胞的细胞毒作用受到影响，这些在蛋白水平上的结果与GSEA算法得到的结果一致，进一步说明了LAP 高表达与CD8+T细胞功能耗竭正相关。

作者接下来根据LAP/ TGFβ表达和CD8 + T细胞浸润水平对TCGA队列和中山医院膀胱癌队列进行生存分析。与高LAP/TGFβ亚组相比，只有低LAP/TGFβ表达的患者从CD8 + T细胞的高浸润中获益，OS显著更好。这些数据表明，在膀胱癌患者中，LAP表达与肿瘤免疫逃逸环境相关，并伴有CD8 + T细胞功能障碍。

4.基于LAP表达和CD8 + T细胞浸润的MIBC合并分类的临床意义

基于上述结果，我们推测LAP相关的CD8 + T细胞功能耗竭与LAP/ TGFβ高表达患者的预后差密切相关。尽管具有低表达LAP/TGFβ并伴有高CD8 + T细胞浸润的患者的OS和RFS明显更好(Fig. 4A, B)，但对于高LAP/TGFβ表达的患者，CD8 + T细胞浸润没有预后价值。因此，我们根据LAP表达和CD8 + T细胞浸润情况对患者进行三分法: cluster I (LAP阳性/TGFβ low &aCD8 + T细胞低水平)，cluster II (LAP +/ TGFβ低)，cluster III (LAP + / TGFβ high ),在ZSHS队列(图4a)和TCGA队列(图4b)。

Kaplan Meier分析比较了三个cluster的临床结果，发现cluster II的患者在两个队列中预后较好。同时，cluster I和cluster III的患者预后无差异。膀胱癌是一种异质性疾病，具有独特的分子表型和免疫环境，药物治疗反应不一，使患者的临床结果和治疗反应性难以预测。有趣的是，作者发现TME分型结合分子亚型可以进一步区分膀胱癌患者的预后。

在TCGA队列中，分析基因突变与膀胱癌亚型(富含间质、神经内分泌样、腔内不稳定、腔内乳头状、腔内非特异性和基底/鳞状)与三个cluster的相关性。但是，常见基因突变在三组间没有显著性差异(图4c)。此外，基底/鳞状(Ba/Sq)亚型在cluster II和cluster III中富集。此外，在Ba/ sq特征的患者中，cluster II的预后较好。(图4d)。此外，在cluster I、cluster II和cluster III中，免疫检查点和抗原呈递特征评分均升高(图4e)，提示我们的新TME分类可能与膀胱癌中免疫治疗的有关。然后，作者从IMvigor210试验中招募了另195名接受PDL1治疗(atezolizumab)的患者来验证这一假设，结果显示cluster III患者对PDL1免疫治疗的反应最差。而cluster II包含了对治疗反应最强 (图4f)。Kaplan Meier分析证实，cluster II的应用PDL1治疗后OS较好 (图4g)。

总的来说,作者的研究结果表明这种新的分类基于LAP表达和CD8 + T细胞浸润水平可用于预测膀胱癌患者的PDL1治疗的预后。

图4 Clinical implication of a combined classification based on LAP expression and CD8 + T cells infiltration in MIBC.

总结

本研究中，作者对膀胱癌的TCGA队列和中山医院队列进行分析，发现LAP可以作为预测膀胱癌患者预后和免疫治疗反应的独立预后指标。此外，根据LAP和CD8+ T细胞评分的分子亚型可以预测患者的免疫检查点治疗反应以及预后，表明LAP在膀胱癌治疗中具有潜在的靶向性。TGFβ 耳熟能详，但是你能想它的前体蛋白LAP的思路嘛？当下的生信分析不断涌现的是更多深入思考后的科学问题，所以好的生信思路还是得专业人士来设计呀~

参考文献：

1. Shi M, Zhu J, Wang R, et al. Latent TGF-β structure and activation. Nature. 2011;4747351:343-349.

2. Annes JP, Chen Y, Munger JS, Rifkin DB. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol. 2004;1655:723-734.

3. Ge G, Greenspan DS. BMP1 controls TGFbeta1 activation via cleavage of latent TGFbeta-binding protein. J Cell Biol. 2006;1751:111-120.

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