今天给大家分享一篇发表在Cancers（IF: 6.639）上的文章:Molecular Subtypes Based on Genomic and Transcriptomic Features Correlate with the Responsiveness to Immune Checkpoint Inhibitors in Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma转移性透明细胞肾癌中基于基因组和转录组学特征的分子亚型与免疫检查点抑制剂的应答率相关免疫检查点抑制剂（ICIs），如程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断剂，已被证明是治疗多种癌症类型的有效药物。尽管肾细胞癌（RCC）的肿瘤突变负荷较低，但它具有独特的免疫学特征，包括高免疫浸润分数和细胞毒性CD8+T细胞浸润的增加。在这种情况下，最近的III期临床试验，如CheckMate 025、CheckMate 214和KEYNOTE 426，表明与酪氨酸激酶抑制剂相比，基于ICIs的方案显著改善了患者的生存率，尤其是在晚期透明细胞癌（ccRCC）。尽管ICIs是目前治疗转移性ccRCC的标准治疗方法，但在多个临床试验中，40–60%的患者仍然对ICIs具有内在的耐药性。因此，识别能够预测ICIs应答者或非应答者的生物标记物具有极其重要的意义。虽然PD-L1表达是预测不同类型恶性肿瘤对ICIs反应性的常规生物标记物，但ccRCC的数据存在异质性，PD-L1表达的预测价值尚不具有临床实用性。与其他实体瘤相比，肿瘤突变负荷和新抗原负荷是ICIs治疗的常用预测因子，但与晚期ccRCC对PD-1阻断的临床反应无关。此外，在接受抗PD-1治疗的ccRCC患者中，根据CD8+T细胞浸润模式，未发现生存差异。最近，几项研究报告，在ccRCC中常见的PBAF复合基因PBRM1的功能丧失（LOF）突变与ICIs更好的临床益处（CB）相关。在这种情况下，全面了解ICIs治疗的ccRCC患者PBRM1突变的分子机制对于开发一种新的生物标记物以及帮助预测哪些患者最有可能从ICIs治疗中获益至关重要。在这里，该研究对ICIs治疗的转移性ccRCC患者进行了靶向测序（n=60）和转录组测序（WTS）（n=61）。通过整合CheckMate 025试验的WTS数据，获得了共177个样本肿瘤的WTS数据，并最终确定了三种分子亚型，它们具有不同的分子表型和PBRM1突变频率。亚型1和3中的患者在ICIs治疗后表现出更差的反应和生存率，较低的PBRM1突变和较差的血管生成，但免疫功能丰富，细胞周期丰富。值得注意的是，亚型2中的患者在ICIs治疗后表现出更好的反应和存活率，PBRM1突变和代谢程序丰富以及较低的耗竭免疫表型。对亚型2的进一步分析表明，GATM（甘氨酸氨基转移酶）作为一种与PBRM1突变相关的新基因，并揭示了其在减少ccRCC肿瘤增殖和抑制ccRCC肿瘤迁移方面发挥关键作用。总之，研究发现经ICIs治疗的转移性ccRCC具有不同的基因组和转录组学特征。并且还发现，新基因GATM可能是一种潜在的ccRCC肿瘤抑制因子，可能与ICIs治疗转移性ccRCC的疗效相关。为了评估经ICIs治疗的转移性ccRCC（n=60）患者的基因组图谱，该研究集中于靶向测序数据，以确定复发性突变基因，并发现17个复发性改变的基因。该队列中最常见的改变基因是VHL（n=34,56.7%）、PBRM1（n=18,30.0%）、SETD2（n=16,26.7%）和BAP1（n=12,20.0%），它们通常与之前报道的ccRCC常见突变基因相似（图1A）。接下来，当对临床受益（CB）组和非临床受益（NCB）组之间的基因特异性改变进行比较时，CB组中17个复发性改变基因中只有PBRM1突变显著富集（图1B）。正如所料，与PBRM1野生型患者相比，PBRM1突变患者的总生存期（OS）显著延长（图1C）。
图1：免疫检查点抑制剂治疗的60例转移性透明细胞癌患者的整体突变图谱
为了深入对ICIs治疗的转移性ccRCC的分子表型的理解，基于与PBRM1突变和PBRM1 LOF相关的四个特征进行无监督聚类分析，并在177名患者中确定了三种分子亚型（图2）。亚型1（n=64，36%）患者的特征是，适度表达与PBRM1突变相关上调和下调的基因，血管生成相对较低，免疫调节特征混合。有趣的是，与亚型1和亚型3相比，亚型2（n=75，42%）患者的特征是与PBRM1突变相关的上调和下调基因的表达模式一致，血管生成的表达相对较高，免疫调节信号的表达相对较低，PBRM1的突变率较高。亚型3（n=38，22%）患者的特征是与PBRM1突变相关的上调和下调基因的反向表达，血管生成的中度表达，以及较高免疫调节信号的富集（图2）。通过整合该研究队列的数据和CheckMate 025数据中的复发突变基因，进一步描述了六种常见突变基因的患病率，并发现亚型2（图2）患者中VHL（n=36,48%）、PBRM1（n=44,72%）和SETD2（n=28,57%）等改变的患病率高于其他两种亚型患者。接下来，为了评估与这些分子亚型相关的关键生物学特征，对每个亚型进行两两比较。首先，亚型1在细胞-细胞信号和细胞发育的生物学过程中富集. 其次，具有高比例PBRM1突变的亚型2上调代谢过程相关通路. 最后，亚型3特异上调细胞周期相关和免疫反应的通路（图2）。
图2：基于PBRM1突变和PBRM1功能丧失相关基因集的亚型特征3.亚型2与更高的代谢过程和较低的耗竭免疫类型有关为了评估每个亚型的预后相关性，根据每个亚型比较OS。值得注意的是，与亚型1和3相比，亚型2与OS显著相关（图3A）。为了进一步了解生存结果的分子机制，通过在每个亚型中使用Hallmark基因集进行基因集富集分析（GSEA）和单样本GSEA（ssGSEA）来探索转录组通路差异。总的来说，18个基因集，包括炎症反应、氧化磷酸化和E2F靶通路，在每个亚型中都被激活（图3B）。亚型1和亚型3中免疫相关通路（炎症反应、补体和IL6-JAK-STAT3）均激活。亚型3特异激活细胞周期进展通路（G2M检查点、E2F靶点和有丝分裂）而比亚型1和2预后更加差。然而，在亚型2患者中，代谢（氧化磷酸化、脂肪酸代谢和脂肪生成）、缺氧和活性氧通路被激活。为了进一步评估每个亚型的免疫相关特征，使用CIBERSORTx反卷积算法分析免疫细胞比例，根据分子亚型，未观察到细胞类型的显著差异（图3C）。有趣的是，亚型3的CD8 T细胞比例较高，这与免疫治疗的作用方式有关（图3C）。这一结果可能与亚型3患者较高的免疫调节活性有关（图2）。鉴于意外发现PBRM1高突变率的亚型2与CD8 T细胞的比例无关，我们研究了不同免疫亚型的肿瘤内在特征是否会影响ICIs的反应。因此，我们分析了分类为激活免疫和耗竭免疫的免疫亚型，据报道，它们在癌症进展中起着不同的作用，并与患者的临床结果相关。与其他两种分子亚型相比，预测每个肿瘤中的免疫类型显示，存活率最差的亚型3表现出耗竭免疫亚型的比例最高，而激活免疫亚型的比例最低。然而，与亚型1相比，亚型1和亚型2的激活免疫亚型比例相似，而存活率良好的亚型2的耗竭免疫亚型比例只有亚型1的一半（图3D）。此外，我们根据PBRM1突变评估了免疫亚型，并确定与未发生突变的患者相比，PBRM1突变的患者表现出更高的激活免疫亚型和较低的耗竭免疫亚型（图3D）。此外，根据免疫亚型评估PFS，包括激活免疫、耗竭免疫和非免疫亚型。我们观察到，免疫激活亚型显示出更好的PFS（图3E）。这些结果表明，每个分子亚型具有不同的免疫亚型，这可能会影响与ICIs反应性相关的肿瘤微环境。此外，ccRCC中激活免疫亚型的过度免疫可能表明ICIs治疗后诱导了攻击性表型和不良预后。
图3：PBRM1突变丰富的亚型2患者与代谢途径和免疫类型转换有关4. GATM表达与PBRM1突变相关，作为ICIs治疗的ccRCC患者治疗反应的新生物标志物接下来，确定与亚型2相关的关键调节基因，该亚型具有较高比例的PBRM1突变，并显示出最佳的生存结果。分析了细胞系数据（GSE102806），包括与PBRM1 LOF相关的786-O和A-704细胞系。首先，通过比较治疗样本和对照样本，得到了六个差异基因集。使用DEGs（包括DEG1、DEG2和DEG3）并通过执行ssGSEA在每个亚型中确定了不同的表达模式（图4A）。值得注意的是，与亚型1和3相比，亚型2的上调DEG表达显著增加，而下调DEG表达显著降低。同样，携带PBRM1突变的肿瘤表现出上调的DEGs的更高表达（图4B）。通过overlap五个差异基因集，鉴定出可能与PBRM1突变有关的四个基因AMACR、SLC6A3、GATM和USH1C上调（图4C）。其中，主要关注GATM和USH1C，在携带PBRM1突变的肿瘤中显著差异表达。然后评估了这两个基因的临床相关性，在TCGA-KIRC数据和合并队列数据中，GATM的高表达与改善的总体生存率（OS）相关（图4D）。在TCGA-KIRC数据中，USH1C的高表达与OS的临床结果相关（图4D），而在合并数据中，没有达到统计学意义（图4D）。因此，在以下分析中，GATM被列为潜在驱动因素。
图4：GATM表达与PBRM1突变和PBRM1功能丧失有关
5. 免疫组织化学检测GATM蛋白水平与良好的生存率相关接下来，为了验证GATM的预后作用，通过IHC染色对51例转移性ccRCC患者的GATM蛋白表达进行评估，并根据GATM表达状态将其分为两组（分为GATM阳性和GATM阴性）（图5A）。然后，研究了GATM蛋白水平与生存结果的关系。值得注意的是，与GATM阴性组相比，在ICIs治疗后，GATM阳性组的PFS和OS显著改善（图5B）。而后，进一步分析了基于PBRM1突变状态和分子亚型的GATM蛋白水平，发现PBRM1突变患者的GATM阳性样本比例高于未发生PBRM1突变的患者（图5C）。此外，还观察到，亚型2的GATM阳性病例比例最高，而具有侵袭性表型和较差存活率的亚型3的GATM阳性样本比例最低（图5C）。这些结果表明，GATM蛋白水平与PBRM1突变状态和侵袭性较低的表型相关，并显示出潜在的临床实用性，可作为ICIs治疗转移性ccRCC的预后标志物。
图5：GATM蛋白在免疫组织化学中的表达状态与良好的生存率有关
6. 在应激条件下，PBRM1缺失和GATM上调会抑制细胞增殖检测了ccRCC细胞系中PBRM1的缺失是否调节GATM的表达。Caki-1和786-O细胞中的PBRM1敲除显示GATM或USH1C表达增加（图6A）。还使用0.5µM放线菌素D（转录抑制剂）检测了PBRM1在转录水平上是否调节GATM的表达。正如预期的那样，与对照细胞相比，在用放线菌素D处理的786-O细胞中，PBRM1敲除后GATM转录物水平持续增加（图6B）。结果表明，PBRM1基因敲除后，GATM的表达在转录水平上增加。随后，将转染siScr、siPBRM1或siGATM的786-O细胞进行体外划痕试验，并与高浓度过氧化氢（H2O2）孵育12小时。与对照细胞相比，暴露于H2O2中的PBRM1敲除786-O细胞几乎没有迁移。PBRM1基因敲除和GATM基因敲除的786-O细胞增强了细胞迁移，GATM基因敲除的786-O细胞的运动性与对照细胞中的相似（图6C）。这些数据表明，PBRM1缺失诱导的GATM上调导致迁移能力丧失。在含有高浓度过氧化氢或低葡萄糖的培养基中培养的PBRM1缺失的细胞失去了形成菌落的能力，通过沉默GATM恢复了这种能力（图6D）。更重要的是，研究了GATM表达和PBRM1突变与临床预后的关系；根据PBRM1突变和GATM表达状态，将合并数据（n=177）和TCGA-KIRC队列分为四组：（PBRM1_MUT+高_GATM、PBRM1_MUT+低_GATM、PBRM1_WT+高_GATM和PBRM1_WT+低_GATM）。正如预期的那样，具有PBRM1突变和GATM高表达的患者都具有最佳的OS（图6E）。这些回顾性分析结果共同表明，PBRM1突变状态和GATM表达被认为是ccRCC患者预后的关键因素。
图6：通过PBRM1基因敲除表达GATM降低应激条件下肾透明细胞癌细胞系的增殖
文章一开始从PBRM1相关分子亚型出发，逐步筛选出与PBRM1相关因子GATM，并且进行了实验验证，在每一个层面都进行了详尽分析，所涉及实验方法和分析方法也相当丰富，文章故事逻辑清晰合理，并且该研究有收集新的样本队列，所以可以到6+。不想错过每天的热点和技术欢迎大家添加生信人为星标推荐
文献 ▎ Molecular Subtypes Based on Genomic and Transcriptomic Features Correlate with the Responsiveness to Immune Checkpoint Inhibitors in Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma