绝了！单细胞转录组联合空间转录组必将成为经典！
近些年，单细胞组学技术和空间组学技术的兴起为科研人员的精准研究提供了坚实的基础，单细胞转录组数据与空间转录组数据的结合分析已然成为癌症治疗研究的新热点。接下来，小编将给大家介绍一下单细胞转录组学联合空间转录组学的经典文章。
Mapping single-cell transcriptomes in the intra-tumoral and associated territories of kidney cancer
一
肾癌瘤内和相关区域的单细胞转录组图谱
文章于2022年11月23日发表在Cancer Cell上。英国韦尔科姆基金会桑格研究所Thomas J. Mitchell等研究人员合作绘制出肾癌瘤内和相关区域的单细胞转录组图谱。作者研究了12名肾脏肿瘤患者的约27万个细胞的单细胞转录组图谱，然后用空间转录组学进行验证。作者发现，CD8+T细胞克隆型的组织类型位置在很大程度上定义了它们的耗竭状态，而肿瘤内的空间异质性并不能很好地解释体细胞异质性。基于scRNA-seq数据的新突变识别使作者能够广泛地推断基质细胞的克隆性和谱系并追踪髓系细胞的分化。此外，作者发现了肿瘤细胞具有六个元程序以及上皮-间质转化程序在肿瘤-正常界面高度富集，并与IL1B+巨噬细胞共同定位，这为肾癌的治疗提供一个潜在的治疗靶点。
以下是结果简述：
1.多区域的肾癌基因组和单细胞转录组分析
样本测序信息：（1）从12名肾癌患者的外周血、正常肾脏、肿瘤核心的四个不同的区域和肿瘤正常界面中采集组织。此外，还采集了肾周脂肪、正常肾上腺、肾上腺转移和肿瘤血栓的组织（图1A），scRNA-seq和scTCR-seq测序数据用于后续分析。（2）8名患者的11个肿瘤正常界面和5个肿瘤核心组织切片进行了空间转录组学。（3）100例样本进行了全外显子组测序（WES）分析。
基于scRNA-seq，根据典型标记基因的表达，可将其大致分为12种主要细胞类型（图1B、1C）。接下来，作者并观察到不同的组织中具有不同细胞类型分布（图1D）。随后，进一步对主要细胞类型进行了亚群分析，从而确定不同组织中105个细胞亚群的差异性分布（图1E）。整合四个最近发表的scRNA-seq数据集并且完善了细胞类型注释，显著改善了其TME的表征（图2）。
对于NK细胞，作者发现主要包括NCAM1和FCGR3A表达亚群和一种表达KRT81和KRT86亚群，其可能主要在肿瘤组织中富集（图1E）。对于内皮细胞，作者鉴定了IGFBP3+EC和胶原相关EC亚群，发现它们在肿瘤组织中显示出显著的富集（图1E）。胶原相关EC在界面中更富集，可能通过细胞外基质（ECM）的产生在TME相互作用中发挥作用。作者还发现界面中可能富集了表达胶原的成纤维细胞亚群（图1E）。这表明，不同的ECM产生基质细胞倾向于在界面中富集和共定位，可能发挥多种功能，包括细胞外环境重塑和细胞间相互作用。
图1：肾癌采样策略和不同组织内主要细胞类型的分布
图2：已发表单细胞数据集的细胞类型注释
2. CD8+T细胞克隆型的扩增及组织定位对其耗竭状态的影响
根据典型标记基因的表达，作者确定了代表不同T细胞功能状态的CD8+T细胞亚群（图3A）。作者鉴定了高度表达组织驻留标记物（ITGAE和CD69）并特异性表达CXCL13的驻留记忆T（TRM）细胞（图3A）。先前研究报道CXCL13+CD103（ITGAE）+ CD8+T细胞在介导人类癌症中的B细胞募集和三级淋巴结构形成中发挥重要作用。他们还发现高表达FGFBP2和CX3CR1的亚群在外周血中显著富集（图3A和1E），因此，该细胞群可能代表激活的效应记忆T细胞（CD8+TEMRA）。还确定了两个高表达LAG3、TIGIT、PDCD1、HAVCR2和CTLA4基因的耗竭型CD8T细胞群，其中有一个群具有最高的LAG3表达，并特异性表达IL10（图3A）。在之前已报到的四个RCC单细胞数据集中未发现表达IL10的CD8+T细胞（图2）。除此之外，作者还鉴定了两个gdT细胞簇，gdT_Vd1（表达TRDV1）和gdT_Vd2（表达TRDV 2），这在之前的四项RCC研究中也没有报道（图2和3A）。
接下来，作者对CD8+T细胞进行了伪时间分析（图3B）。随着伪时间，发现细胞毒性相关基因（KLRG1、GNLY和GZMH）逐渐下调，而耗竭相关基因（CTLA4、HAVCR2和LAG3）逐渐上调（图3C）。然而，前体耗竭相关基因（CXCR4、GZMK和GZMA）先上调，然后沿着伪时间逐渐下降（图3C）。此外，将前十个扩增的TCR克隆型映射到轨迹上，观察到单个TCR谱系通常被限制在相似的表型状态，而不是分布在整个轨迹上（图3D）。在多个患者中观察到高度扩增的TCR克隆，每个克隆有100多个细胞，其中显著高达30%的CD8+T细胞可来自单个克隆型（图3E）。在耗竭的克隆型中，许多最扩增的CD8+TCR克隆具有相当比例的细胞周期循环细胞（图3E）。这一发现与之前在黑色素瘤中的发现类似，肾癌中高度耗竭的T细胞的增殖尚未完全停止。作者还发现，无论克隆大小，平均耗竭程度和外周血中检测到的CD8+TCR克隆型都是强反相关的，并且在外周血中很少检测到耗竭的克隆型（图3F）。就耗竭程度而言，CD8+T细胞的表型状态显示出对克隆扩增和组织位置的强相关性（图3G）。
图3：CD8+T细胞特征
3. 空间定位主要影响CD8+克隆型异质性
作者利用WES数据中的体细胞突变构建了系统发育树，以阐明肿瘤的克隆进化和ITH，发现大多数检测到的驱动突变和关键CNV由单个肿瘤内的所有肿瘤克隆共享（图4A）。除此之外，作者通过比较了个体肿瘤中CD8+T细胞的体细胞突变、空间定位和TCR克隆型之间的关系，发现肿瘤相关的克隆型在单个区域中频繁富集（图4B）。在肿瘤细胞上产生新抗原的体细胞突变被认为是抗原呈递后T细胞克隆扩增的驱动因素。这一发现表明，TCR克隆扩增的异质性更多地与组织中T细胞的不同空间定位有关，而不是与体细胞突变的ITH有关。随后作者通过验证发现CD8+T细胞中的TCR异质性与空间定位比与体细胞异质性更密切相关（图4C）。
作者还使用GLYPH2算法对预测识别相同表位的TCR进行聚类，共检测到了扩展克隆型之间共享的六种模式（图4D）。其中一种模式（SQDR%TDT）在两种克隆型的不同肿瘤区域富集。其中两种模式（SLGAG%TE和SVGQ%YE）代表着在成熟的不同阶段出现的克隆型，每种模式都有一种克隆型存在于外周血和正常组织中，另一种模式在高耗竭水平的肿瘤中富集（图4D）。
图4：体细胞突变与TCR克隆型异质性的关系
4. 髓系细胞的区域特征和进化
作者对髓细胞亚群分析，发现簇1、2、3和4 高表达CD14但缺乏FCGR3A表达为经典单核细胞主要存在于外周血中。簇5代表循环非经典单核细胞，FCGR3A高表达，但CD14缺乏表达。还鉴定了三种树突状细胞（DC）簇：pDC、cDC1和cDC2，其特征分别是JCHAIN、CLEC9A和CD1C的特异性表达（图5A），以及肥大细胞特异性高表达TPSAB1，可能在肿瘤核心中富集（图5B）。
作者还发现与其他正常组织相比，六个巨噬细胞簇（簇11–16）优先富集于肿瘤核心/界面，因此被定义为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。其余三个簇（簇6、簇7和簇8）在正常组织/界面中显示富集，并被视为组织驻留巨噬细胞（TR Mac）（图5B）。在六个TAMs簇中，MHC-II TAM（簇14）高度表达HLA-DRB5、APOE和APOC1，并且在肿瘤核心中比在肿瘤正常界面中更富集。相比之下，其他五个TAM簇在肿瘤核心和界面显示出相似程度的富集（图5B）。FN1+TAM高表达FN1和MARCO（图5C），其先前被报道为肾癌中的特异性巨噬细胞亚群。还发现，FN1+TAM可能是RCC中的促瘤因子，该细胞群上调MDSC和M2极化相关基因（图5D）。并且发现还高表达APOC4-APC2和TREM2基因的SPP1+TAM簇（图5C）。在三个TR Mac群中，TR Mac.2在界面处富集（图5B），并且高度表达IL1B和AREG（图5C）;TR Mac.3显示SEPP1和MRC1的高表达，并且在正常肾上腺中富集（图5B和5C），但是TR Mac.3具有极高的M2和吞噬细胞特征表达，并表现出与FN1+TAM簇相似的通路激活（图5D、5E）。使用RNA速度分析，作者发现组织中从循环单核细胞到巨噬细胞有两种明显的定向流动：（1）从经典mono.3至TR Mac.2和（2）从非经典mono至TR-Mac.1，TR Mac.1和TR Mac.2然后可能在组织中产生其他类型的巨噬细胞（图5F）。随后，作者利用体细胞突变分析（图5G），发现循环单核细胞与组织中的巨噬细胞分离，与其他经典单核细胞相比，非经典单核与组织中巨噬细胞的关系更密切。
图5：髓系细胞特征、区域富集和进化
5.肿瘤细胞元程序以及区域富集和预后
作者使用NMF解析了由每个肿瘤中的共表达程序，从10个ccRCC肿瘤中解析了45个瘤内表达程序，得到了多个肿瘤共享的六个元程序（MP）（图6A，6B）。MP1高表达FOS和JUN，代表了肿瘤细胞中的应激反应相关特征。MP2高表达了近端小管（PT）细胞特异性表达的基因（NAT8和ACSM2B）。MP3上调了TGFBI和MT2A等基因（图6B），这些基因与上皮间质转化（EMT）有关（图2）。MP4高表达NEAT1和HCG18，反映了一些应激或细胞死亡（CD）相关的细胞状态。MP5高表达MHC II相关基因如CD74和HLA-DRA。MP6高表达TOP2A和MKI67，与肿瘤细胞的增殖有关。
接下来，整合肿瘤细胞分析发现与肿瘤核心相比，EMThigh肿瘤细胞在肿瘤正常界面（肿瘤前缘）更富集，这反映了EMT状态代表肿瘤细胞更具侵袭性的状态（图6C，6D）。然而，PT程序主要富集于肿瘤核心区域。使用cell2location算法，在空间转录组数据中PT/EMT程序的空间分布模式（图6E、6F）。此外，作者发现TCGA分子亚型m3（预后差）显示出显著更高的EMT分数，但PT分数更低（图6G）。
图6：肾癌肿瘤细胞元程序以及区域富集和预后
6. IL1B+巨噬细胞与高EMT 肿瘤细胞的空间相关性
作者使用NicheNet分析，发现巨噬细胞来源的IL1B对这些EMT基因显示出较高的调节潜力（图7A），推测通过肿瘤细胞中表达的受体IL1R1。有趣的是，IL1B由富集在肿瘤正常界面处的TR Mac.2特异表达（图5B 、5C）。并且在许多组织切片中发现，IL1B+巨噬细胞与EMThigh 肿瘤细胞的相关性最强（图7B和7C）。
图7：肾癌肿瘤微环境中的细胞相互作用
二
其他单细胞转录组与空间转录组联合分析文献介绍
1. 单细胞和空间转录组分析揭示结直肠癌中FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用
Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer于2022年4月发表在Nature Communication期刊上，作者通过整合分析scRNA-seq数据、公开发表的scRNA-seq和bulk RNA-seq数据集、空间转录组数据，证实FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用阻止T细胞浸润，并发现FAP或SPP1高表达的患者在抗PD-L1治疗队列中获得的治疗益处较少。这一结果表明可以通过破坏FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用来改善免疫治疗，提供了一种潜在的治疗策略（图8）。
图8
2. 整合单细胞RNA测序与空间转录组学揭示间质性膀胱炎的免疫景观
Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis于2022年5月发表在signal transduction and targeted therapy期刊上，该文章结合scRNA-seq和空间转录组进行了全面的表型和功能研究，构建了间质性膀胱炎（IC）膀胱组织免疫细胞图谱（图9）。
图9
3.识别正常和肿瘤表型相关的细胞亚群
A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers于2021年9月发表在Nature genentics期刊，该文章作者开发了一种内在亚型分类方法（SCSubtype）来揭示复发性肿瘤细胞异质性。对人类乳腺癌组织进行了单细胞转录组和空间转录组学分析，将其分为九类，称为“生态型”，每一种“生态型”具有独特的细胞组成和临床结果（图10）。
图10
三
小编总结
目前scRNA-seq将每个基因与单个细胞相关联，但在组织中的位置信息却丢失了；相反的，空间转录组学技术知道这些细胞的位置，却不知道是哪个细胞表达了哪个基因。因此，单细胞转录组数据和bulk转录组数据：优势互补，将单细胞转录组数据和空间转录组学数据进行有效结合可以空间上绘制发育和疾病中的特定细胞亚群，并阐明这些细胞亚群协同形成组织表型的机制，提供崭新的治疗策略。
END
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