近5年30篇高水平文章！双料院士Regine Kahmann课题组阐明玉米黑粉菌致病机理！

今天为大家介绍来自德国马克斯普朗克陆地微生物研究所的Regine Kahmann课题组。Kahmann教授是欧洲科学院和德国科学院双料院士，1972年哥廷根大学理学硕士，1974年柏林自由大学生物学博士，1980年美国冷泉港实验室博士后，1982年马普学会生化研究所研究助理，1986年马普学会分子遗传研究所课题组长，1992年柏林基因生物学研究所课题组长，1992年慕尼黑大学遗传与微生物研究所教授，2000年马普学会陆地微生物研究所生物互作系主任，2001年马尔堡大学遗传学教授。

Kahmann教授长期以玉米和玉米黑粉菌为研究材料从事病原菌的发育和致病机理研究，早年在病原菌的生殖、发育、交配等方向上做出了诸多的经典研究，近年来她所领导的课题组从玉米黑粉菌的基因组和病原菌效应蛋白入手，系统阐释了病原菌致病的分子机理。Kahmann教授在Science、Nature、Cell、PNAS、Plant Cell、EMBO J等杂志上发表了大量高水平研究论文。她所领导的课题组培养出了一批国际知名植物病理学家，是公认的植物学的学术大家。

经查询该课题组近5年（2015-2020）发表了30篇文章，其中包括Nature (2019)、Nature microbiology (2019)、Nature Communications（2018）、Nature Reviews Microbiology (2017)、Plant Cell (2018)、Current Opinion in Microbiology (2018)、Current Opinion in Plant Biology（2017）、Plos Pathogens (2016)、Annual Review of Plant Biology（2015）和5篇New Phytologist（2016, 2018, 2020）等高水平通讯文章。该一系列成果在玉米抗黑粉菌分子机制及玉米黑粉菌致病机理中取得重大突破，具有重大的科学价值和应用潜力！详细文章见如下：

多年前，Kahmann教授就开始致力于研究一种感染玉米并引起黑穗病的真菌--Ustilago maydis。这种致病菌在被感染的植物中会引起大的肿瘤（图1A），但在温室条件下，一周内也会使小玉米苗致病（图1B）。Kahmann课题组使用这种微生物-植物相互作用系统来了解真菌如何感染植物。为了在植物组织中成功定殖，U.maydis分泌一系列新颖的效应蛋白。这些效应蛋白被用来抑制植物的免疫反应，并重新调控宿主的新陈代谢以满足真菌的需求。该课题组的目标是确定这些效应蛋白在分泌后的最终去向，它们的分子功能是什么，它们在病原菌和宿主之间的军备竞赛中是如何进化的，以及它们的表达是如何被调节的。

该课题组最近的研究成果解读：

1 鉴定了重复性Rsp3效应蛋白的分子功能

据预测，Rsp3是一种缺乏GPI锚的非加工的重复蛋白。在信号肽的下游，有一个富含谷氨酰胺和脯氨酸的区域，然后是一个富含半胱氨酸的区域。构成分子一半以上的长C端域由几个不同的重复单元组成的复杂阵列。在田间分离物中，rsp3显示出强烈的长度多态性，这是由C端域的缺失和重排造成的。rsp3在活体营养阶段高度表达，是毒力和花青素积累所必需的。与野生型侵染相比，rsp3突变体在感染组织中只积累很少的真菌生物量。通过免疫定位，已经表明Rsp3附着在生物菌丝的表面并装饰其表面。为了阐明Rsp3的功能，作者通过联合免疫共沉淀确定了Rsp3的玉米交互体。这些研究表明，Rsp3至少与两种分泌的玉米DUF26域家族蛋白相互作用，指定为AFP1和AFP2。这些蛋白与银杏叶种子中的一种甘露糖结合抗真菌蛋白有关。作者已经表明，AFP1玉米蛋白也能结合甘露糖，并对rsp3突变体显示抗真菌活性，但对组成性表达rsp3的菌株不显示（图2）。对AFP1/2进行沉默的玉米植株可部分挽救rsp3突变体的毒力缺陷，说明Rsp3效应蛋白阻断AFP1/2的抗真菌活性是重要的毒力功能。Rsp3同源蛋白存在于所有的黑粉菌中，来自Sporisorium reilianum的同源蛋白可以回补U.maydis的rsp3突变体，这表明一种新的广谱真菌保护机制。还可以证明AFP1/2沉默的植物变得更容易受到无关真菌Colletotrichum graminicola的影响。这揭示了作者发现的抗真菌玉米蛋白在限制植物感染真菌的生长方面发挥了更普遍的作用。

图2：Rsp3功能的模型。在野生型U.maydis菌丝（左）中是Rsp3蛋白（粉红色椭圆）附着在表面，提供保护，防止甘露糖结合的抗真菌玉米蛋白AFP1和AFP2（双叶结构）。当Rsp3缺失时（右），AFP1和AFP2会攻击并杀死真菌菌丝。这可能会释放甘露糖化的细胞壁片段，这些片段可能会与位于植物质膜上的含有甘露糖结合受体激酶的DUF26域结合（双叶结构与绿框相连），这可能会引起植物防御反应。

2 鉴定了分泌的分支酸变位酶Cmu1效应蛋白的结构，并确定了一种玉米kiwellin作为Cmu1的交互体

U. maydisis的分泌分支酸变位酶Cmu1是一种易位毒力促进效应蛋白。玉米细胞质中的Cmu1被认为可以降低叶绿体中的分支酸盐水平，在该处它将作为植物防御激素水杨酸（SA）生物合成的前体。这降低了感染U. maydis的组织中的SA水平，这有利于活体营养生长。Cmu1的晶体结构是与G. Bange教授（马尔堡SYNMIKRO）合作鉴定的。

通过对感染的叶子组织中的Cmu1-HA进行免疫沉淀，然后进行质谱分析，可以确定分泌的玉米蛋白ZmKwl1为特异性相互作用因子。ZmKwl1是kiwellin家族的成员之一，该家族在玉米中有13个成员。体外pull-down实验证实了Cmu1和Kwl1之间的相互作用。重组Kwl1蛋白能抑制Cmu1的分支酸变位酶活性。Kwl1的表达在被U.maydis感染后被强烈诱导，说明Kwl1很可能是一种致病相关蛋白。氢-氘交换质谱(HDX/MS)将Cmu1和Kwl1之间的相互作用界面映射到Cmu1的环路区域。截断Cmu1中的环路，取消了与Kwl1的相互作用。各个突变蛋白只允许Δcmu1突变体的部分互补。这说明Cmu1和Kwl1之间的相互作用与U. maydis的毒性有关。通过在玉米中沉默Kwl1并证明沉默的植物更容易感染U.maydis，进一步证实了这一点。Kwl1特异性阻断了Cmu1的催化活性，而Cmu1的活性不受植物代谢物的全能控制。Cmu1-Kwl1复合物的结构揭示了两种蛋白之间的亲密相互作用(图3)，并表明Kwl1阻碍底物进入Cmu1的活性位点。与S.Rensing教授(Philipps Universität Marburg)合作完成的系统发育分析表明，植物中广泛保守的kiwellin蛋白呈现出一种专门对抗病原分子的多功能支架。

图3：Cmu1-Kwl1复合体的3D结构。该模型显示了由两个Kwl1分子（蓝色）紧密结合的Cmu1二聚体（绿色）的相互作用。

3 通过对U.maydis在感染的所有阶段进行RNAseq剖析，发现效应蛋白在感染过程中以离散的波段表达

作者对U.maydis野生型菌株在感染后12小时至12天之间启动的整个植物相关发育通过RNAseq进行了深入的转录谱分析。在这个分析中，主要关注真菌代谢、营养策略、分泌效应蛋白和调节网络。发现了14个离散的表达模块，可以将U. maydis基因分配到这些模块中。在养分利用方面，观察到一些营养转运蛋白的表达与这些毒力模块有关，而不是受养分的可用性控制。作者表明，可能参与氮同化的寡肽转运蛋白是重要的毒力决定因素。分泌蛋白以特征性的表达波表达，表明它们只是短暂的需要（图4）。作者还表明，先前观察到的许多效应基因在感染后期的下调与表达异质性有关：在嵌入多糖基质的分生聚集体中，在这些结构的中心观察到下调，而聚集体外围的细胞继续表达各自的效应基因。在14个表达模块中，有3个模块的分泌蛋白富集，分别对应于植物表面的阶段、活体营养的建立和肿瘤的诱导。这些模块很可能是U.maydis毒力的关键决定因素。通过测量转录因子的模块内连通性，确定了这些毒力模块的潜在驱动因素。虽然b-mating型级联的已知成分出现了植物表面和活体营养模块的诱导因子，但确定了一组尚未被描述的转录因子可能负责肿瘤模块的表达。虽然缺乏其中一个转录因子(Nlt1)的突变体在叶组织中表现出正常的增殖并诱导花青素的形成，但它们无法诱导叶肿瘤。对野生型和突变体感染组织中的效应基因表达进行比较后发现，在nlt1突变体中，效应基因的表达被特异性地废除。这使得Nlt1调控的一个或几个效应蛋白很可能是诱导叶肿瘤的原因。

图4：分泌的U.maydis蛋白在玉米定植过程中的离散波表达。热图显示了编码假定分泌蛋白的不同基因的表达。

4 鉴定了具有正向选择特征的效应蛋白基因，并研究了它们对毒力的贡献

为了研究效应基因的进化及其对毒力、物种化和宿主特异性的贡献，作者采用了最近测序的Sporisorium reilianum f.sp.reilianum SRS1_H2-8(寄主植物芡实)的基因组，以及U. maydis(寄主植物玉米)、Ustilago hordei(寄主植物大麦)、Sporisorium scitamineum(寄主植物甘蔗)和S.reilianum f.sp.zeae(寄主植物玉米)的基因组(图5)，以确定具有正向选择特征的潜在效应蛋白基因。为了确定这种候选效应蛋白是否在毒力中起作用，在S.reilianum f.sp.zeae中单独删除它们，并在感染玉米后评估删除株的表型。在9个被测试的候选效应蛋白中，只有一个显示出对毒力有很大的贡献，这表明大多数具有正向选择特征的基因对毒力有贡献，或者在S.reilianum f.sp.zeae中被选择的性状与毒力没有直接关系。

图5：用于鉴定具有正选择迹象的效应基因的黑粉菌系统发育。

5 成功地改造了CRISPR-Cas9系统，使其能够针对U. maydis中的基因家族进行复用

采用CRISPR-Cas9基因组编辑系统，不仅可以有效地破坏单个基因，而且为同时破坏具有相同靶序列的基因打开了大门。利用该系统的性质，一个sgRNA可以被设计成针对多个基因中存在的保守区域。在U.maydis中，只有少数几个效应蛋白有相同的序列，可以通过这种方式被破坏。作者以eff1效应蛋白家族的两个效应蛋白基因的保守区域为目标测试了这种可能性。在这种情况下，这两个基因在基因组中彼此相邻，诱导编辑导致所有情况下裂解位点之间区域的染色体缺失。

为了使缺乏序列同一性延伸的基因家族的成员失活，需要与Cas9蛋白同时表达几个sgRNA。作者选择了一种多质粒策略，并修饰了Cas9表达质粒以包含多个sgRNA表达盒（图6）。sgRNA表达盒由tRNA启动子和sgRNA组成，可以使用Gibson组装轻松地克隆到Cas9表达质粒中。由于多重结构中Cas9介导的基因组编辑的效率可能由于不同sgRNA竞争Cas9蛋白而降低，因此作者通过插入更强的启动子来增加Cas9的表达，并在转化后实施了额外的选择和孵育步骤以增加Cas9在细胞中的作用时间。作为概念的证明，作者生成了针对五个属于eff1效应蛋白家族基因的复用构建体。按照修改后的方案，有70％的测试转化子在所有五个基因中均显示出基因编辑。

图6：在U.maydis中构建的用于Cas9靶向几个基因的质粒示意图。

6 证明U. maydis的Tin2效应蛋白已经被新功能化

U.maydis的Tin2效应蛋白是少数分子功能已被阐明的效应蛋白之一。Tin2稳定了玉米蛋白激酶TTK1，而TTK1调节花青素的生物合成。花青素生物合成的诱导被认为会消耗对香豆酸的水平，而香豆酸也是木质素生物合成的前体。木质化程度的降低对于真菌在感染组织中的传播是很重要的。作者现在从功能上比较了U.maydis和相关的黑粉菌Sporisorium reilianum的Tin2效应蛋白。S.reilianum也感染玉米，但只在花序中引起症状，并且未能诱导花青素(图7)。S. reilianum在基因组的一个合成位置上藏有一个与U. maydis的tin2相关的基因。S.reilianum的tin2基因也对毒力有贡献。作者发现，这两种真菌的tin2效应蛋白分别靶向玉米蛋白激酶TTK1的不同旁系物，导致稳定和抑制。作者还重建了一个祖先的Tin2效应蛋白，并证明它可以在功能上替代S.reilianum Tin2的毒力功能，但不能诱导花青素，也不能替代U.maydis的Tin2。这表明U. maydis Tin2诱导花青素的能力是一种获得性的特化功能。作者认为这种特化功能很可能与该真菌独特的致病生活方式和诱导叶片肿瘤的能力有关，而S.reilianum不具有这种表型。

图7：玉米的U. maydis和S.reilianum疾病症状。A）穗轴上的两种黑穗病真菌的症状。B）叶片中两种黑穗病真菌的症状。

更多精彩内容，点击下方“往期回顾”

喜欢就转发、收藏，点“在看”