植物病原真菌通过异硫氰酸酯水解酶抵抗植物葡萄糖苷酸防御机制

十字花科植物可产生硫代葡萄糖苷和黑芥子酶，从而产生有毒的异硫氰酸酯对病原菌和昆虫具有广泛的抗性。然而，一些普遍的病原真菌，如死体营养的Sclerotiniasclerotiorum，能够感染许多植物宿主，包括硫代葡萄糖苷的生产者。在这里，结果表明S.sclerotiorum的侵染激活了植物硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系和异硫氰酸酯，有助于植物抵抗这种真菌。S.sclerotiorum代谢异硫氰酸酯通过两种独立的途径：与谷胱甘肽共轭，更有效的是，将其水解为胺类。后一种途径是通过异硫氰酸水解酶将异硫氰酸酯转化为对真菌没有毒性的化合物。异硫氰酸酯水解酶能促进真菌在毒素存在的情况下的生长，并有助于提高S. sclerotiorum在植物中的毒力效应。

所有生物都会使用化学防御系统以抵御他们的天敌，但部署了这些防御措施可能会对生产者产生负面影响。产生无毒的毒素前体可在需要的时候被激活是许多植物使用的一种策略，以阻碍病原菌和食草动物的攻击，同时避免了自身毒性。例如，十字花科植物产生氨基酸衍生的硫代葡萄糖苷（GLs），它们是被β-硫代葡萄糖苷糖水解酶激活，在组织损伤时产生有毒的异硫氰酸酯(ITCs)和亚硝酸盐。这种所谓的"芥子油炸弹"能够防御许多食草昆虫和病原菌的攻击。然而，十字花科作物如油菜、卷心菜和西兰花仍然受到特殊昆虫和病原微生物的严重攻击。

与病原菌相比，对植物GLs的防御作用的研究更多是针对食草动物。然而拟南芥pen2突变株，在激活吲哚GLs的过程中是无效的，被发现更容易受到Blumeria graminis和Erysiphepisi的影响，表明吲哚GLs是一种广谱的抗真菌化合物。同样，死体营养的Botrytiscinerea在吲哚GLs缺失的拟南芥突变株中显示出更强的毒力。另一方面，脂肪族GLs也有助于植物对特定病原菌的抗性。虽然大多数关于GLs在病原菌抗性方面的研究都涉及色氨酸衍生的吲哚GLs，但是一株缺失4MSOB-GL合成基因的拟南芥突变体，被发现更容易受到Fusariumoxysporum的影响。

一些食草昆虫和病原菌在十字花科植物定殖的能力归因于它们代谢GLs和ITCs的能力。一些专门的食草昆虫可以通过代谢GLs防止有毒物质ITCs的形成。然而，大多数食草昆虫不能阻止GL激活，但却用一般的谷胱甘肽（GSH）依赖的巯基酸途径共轭GL水解产物从而使其失活。有趣的是，据报道细菌可以水解ITC以解毒，但其解毒方式显著区别于食草昆虫，通过金属β-内酰胺酶(MBL)水解酶（ITCases）将ITCs降解为羰基磺酰基及其相应的化合物。ITC酶编码基因SaxA首次在致病性丁香假单胞菌中被报道，其为细菌对ITCs的抗性所需。随后，SaxA从一些以十字花科植物为食的食草昆虫肠道细菌中被提取出来，它被认为能促进宿主幼虫对ITCs的耐受力。最近，在Psylliodes chrysocephala中胺和其相应的乙酰化衍生物（乙酰胺）被检测到作为ITC的次级代谢产物，但不知道这种转换是否由昆虫本身或其相关的微生物群进行。尽管我们对昆虫和细菌的GL代谢有一定的了解，但对真菌的GL代谢以及致病真菌如何应对GLs的毒性并定殖十字花科植物还知之甚少。

Sclerotiniasclerotiorum是其中一个最具代表性的菌株，它是一种破坏性强、地理分布广泛的真菌性病原菌，能引起400多种植物的白霉病，包括重要的GL合成物种十字花科植物。之前的一项研究表明，脂肪族ITCs在体外能抑制S. sclerotiorum的生长。表明脂肪族GLs在十字花科植物中对这种真菌病原菌具有潜在的防御作用，而其他研究则描述了十字花科几种非GL化学防御物的选择性代谢。

在这里，研究了GLs在植物中与S. sclerotiorum相互作用的更多细节，并探究了真菌在生长过程中避过GLs使植物感染的新陈代谢机制。研究结果支持了蛋氨酸衍生的脂肪族GLs对抗这种真菌的防御作用，GL-黑芥子酶系被激活合成有毒的ITCs。然而在S. sclerotiorum侵染宿主植物期间，ITCs会被有效地降解，其中包括通过酶的水解作用。我们对ITC水解酶进行了鉴定和表征，结果表明这种降解作用途径有效降低了ITCs的毒性。最后，S.sclerotiorum ITC水解酶-突变株的表型分析表明这种ITC降解途径对真菌定殖产GL的宿主植物至关重要。

ITC缺失的植物更容易受到S. sclerotiorum的影响

图1拟南芥脂肪族ITC-和GL-无效突变体对S.sclerotiorum超易感。a 比较S.sclerotiorum接种后24小时(hpi)在拟南芥Col-0野生型、tgg1/tgg2和myb28/myb29突变体叶片上引起的病变区域。tgg1/tgg2系是一个肌氨酸酶缺失的突变体，而myb28/myb29植株缺失脂肪族GL生物合成。 b S. sclerotiorum生在拟南芥生长24 h的相对定量。

S. sclerotiorum可降低叶片和培养物中的ITC水平

图2 4MSOB-ITC被真菌S. sclerotiorum降解。a 接种或不接种S.sclerotiorum拟南芥中4MSOB-ITC的定量。b 真菌培养物中4MSOB-ITC的定量。c 4MSOB-ITC巯基酸途径的共轭物和d 4MSOB-ITC水解降解产物4MSOB-胺和4MSOB-乙酰胺在4MSOB-ITC添加的真菌接种液体培养基中的定量。e S. sclerotiorum降解4MSOB-ITC途径。

ITCs可诱导S. sclerotiorum ITC水解酶-编码基因的表达

图3 Ss12040是S. sclerotiorum中的一个SaxA候选基因。a 真菌金属β-内酰胺酶类酶与已知细菌ITCases相似性的最大似然树。b 通过4MSOB-ITC在体外诱导SaxA候选基因Ss12040的表达。

SsSaxA(Ss12040)可降解脂肪族和芳香族ITCs

SsSaxA介导S. sclerotiorum中ITCs的水解作用

图4 用4MSOB-ITC和2PE-ITC异源表达的SsSaxA的酶动力学分析。

图5 2PE-ITC而不是其代谢产物2PE-胺和2PE-乙酰胺能降低S. sclerotiorum的生长。

SsSaxA缺陷株在培养中对ITCs敏感

图6 SsSaxA缺失减少了ITC 降解效率以及在添加ITC的培养基上的生长。a 4MSOB-ITC在野生型（WT）和ΔSsSaxA-1菌株中的定量。b 4MSOB-胺和4MSOB-乙酰胺和 c 4MSOB-ITC共轭物在添加4MSOB-ITC培养基中野生型和ΔSsSaxA-1菌株的定量。

SaxA的缺失降低了真菌在ITC防御植物中的致病性

图7 ΔSsSaxA突变株在拟南芥Col-0中的毒力明显比野生型真菌低。a 拟南芥Col-0 b 比较野生型和ΔSsSaxA突变株在拟南芥叶子侵染24 h造成的病变面积。

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