Plant Cell | 劳伦斯伯克利国家实验室通过种内多样性分析揭示了高度可变的植物免疫受体！

植物具有两种病原体识别受体：细胞外受体类激酶和蛋白（RLKs和RLPs）以及细胞内结合核苷酸的亮氨酸富集重复序列（NLR）受体（Journal of Biological Chemistry | 深度解读植物免疫系统的分子基础！New Phytologist | 德国马克斯普朗克植物育种所柴继杰课题组综述植物防御中的结构生物学！）。NLR由三个主要域组成：激活时介导受体寡聚化的中心核苷酸结合域（NB-ARC）、定义受体特异性的C端富亮氨酸重复序列（LRR）域和介导免疫的N端域。基于后一个域，NLRs分为三个单系类别：RNLs（抗白粉病8）、CNLs（卷曲螺旋）和TNLs（Toll /白介素-1受体同源）（Science | 清华大学和马普所重磅研究！植物免疫受体：一个巴掌拍不响！Science | 重磅！加州伯克利研究揭示植物抗病小体ROQ1识别病原菌效应蛋白新机制！Science | 专家点评：植物NLR免疫受体与植物防御反应！Molecular Plant | 王国梁和宁约瑟团队研究揭示NLR介导的水稻抗病新机制）。NLRs可以是传感器或信号传感器。作为传感器，NLR可以通过直接结合效应因子，识别效应因子对其他蛋白质的作用或识别对非经典NLR域的修饰来识别病原体。为了跟上一系列快速发展的病原体的步伐，需要不断产生NLR的多样性（Nature Reviews Immunology | 重磅！Paul Schulze-Lefert综述NLR介导的植物免疫！Cell Host & Microbe | 加州大学河滨分校金海翎团队揭示染色质重塑蛋白调节植物免疫受体NLRs！PLOS Pathogens | Paul Schulze-Lefert团队揭示mla NLR对大麦白粉病菌的特异性免疫机制！）。

近日，国际权威植物学期刊Plant Cell发表了劳伦斯伯克利国家实验室Daniil Prigozhin和加州大学伯克利分校Ksenia Krasileva的最新相关研究成果，题为Analysis of intraspecies diversity reveals a subset of highly variable plant immune receptors and predicts their binding sites的研究论文。同时，比利时根特大学的Judith Van Dingenen在Plant Cell上撰写了同名的研究简评。

序列比对的香农熵分析已成功用于鉴定决定免疫球蛋白受体特异性的高度可变残基。在这项研究中，Daniil Prigozhin和Ksenia Krasileva使用这一现有理论来研究泛NLRomes中的序列多样性。作者描述了一种新的方法来研究泛NLRomes，它使用现有的拟南芥种质和二穗短柄草谱系的数据补充了先前的分子进化分析。

首先，使用基于系统发育的方法，根据它们共享的NB-ARC域对NLRs进行了新的分类。由此，研究人员规避了基于距离的聚类技术可能发生的每个基因失去稳健的等位基因系列的问题。由此产生的亚族在大小和序列多样性上存在差异，这表明紧密相关的NLR序列在整个NLR家族中以不同的进化速率进化。

图1. 拟南芥泛NLRome的系统发育分析

接下来，研究人员使用香农熵分析了亚家族比对的多样性，并定义了高度可变的NLRs（hvNLRs）。在这些受体中，高度可变的残基有望形成目标结合位点。在植物中，已知LRR结构域具有识别特异性，实际上，高变残基主要位于那里，尽管它们的确切位置在NLR亚家族之间有所不同。一个简单易读的矩阵表示香农熵分数映射到LRR重复序列上（行：重复单元，列：标准LXXLXLXX重复序列中的可变位置），允许跳过结构预测，如RPP13所示。

图2. 高度可变的NLRs的鉴定和系统发育分布

图3. LRR表面的2D表示允许在没有实验结构的情况下比较预测的NLR结合位点

图4. 在Col-0 NLR树的背景中，Col-0 hvNLR LRR表面的2D表示

为了验证结合位点的预测，研究人员集中研究了RPP13，这两个都是著名的NLR抗病基因。研究人员使用了在Col-0和Nd等位基因之间转移了高度可变残基（熵>1.5）的合成RPP13变体，并将ATR13效应因子作为瞬时烟草实验中的靶标，研究人员证实了靶标识别需要高熵残基的要求。

图5. RPP13中高度可变的残基与观察到的ZAR1-RKS1结合位点重叠，是ATR13识别所必需的

图6. RPP1接触残基显示高序列多样性

最后，对短柄草属的类似分析表明，基于系统发育的NLR分析与香农熵矩阵相结合也可以应用于非模式植物。未来的自动化算法将进一步简化这种计算型泛NLRome分析工具。补充结构和突变实验，以确认基于熵的靶标结合位点的预测，将有助于说服其他研究人员使用这种方法。

图7. hvNLRs在二穗短柄草Bd21（蓝带）和拟南芥Col-0（绿带）的联合系统发育中的分布

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