Science | 重磅！加州伯克利研究揭示植物抗病小体ROQ1识别病原菌效应蛋白新机制！

植物和动物通过与胞内核苷酸结合的富含亮氨酸的重复受体（NLR）对病原菌入侵做出反应，这些受体直接与病原菌蛋白质相互作用或间接检测宿主蛋白质组中的病原菌衍生变化（Molecular Plant | 王国梁和宁约瑟团队研究揭示NLR介导的水稻抗病新机制）。识别病原菌入侵后，NLR会触发免疫反应，具体取决于被激活的NLR的类型，该反应以多种方式分解。NLR的总体结构是高度保守的，由决定底物特异性的C末端富含亮氨酸的重复（LRR）平台和中央核苷酸结合寡聚域组成（Nature | 重磅研究揭示过氧化氢受体HPCA1是拟南芥中的LRR受体激酶！近五年7篇CNS！美国杜克大学董欣年院士团队在植物免疫领域取得重大进展！）。N末端结构域在NLR之间变化，并决定宿主用来激活免疫应答的机制。因此，植物中的NLR已根据其N末端结构域分为Toll /白介素1受体（TIR）NLR（TNL）、卷曲螺旋NLR（CNL）和RPW8类NLR（RNL）。NLR的病原菌检测和寡聚通过使它们紧密接触来激活这些N末端结构域。在所有这三种情况下，N-末端结构域的缔合导致局部细胞死亡和抗病性表达（Cell Host Microbe | 重磅！德国马普所发现植物独立进化出了与动物相似的免疫蛋白家族；New Phytologist | 德国马克斯普朗克植物育种所柴继杰课题组综述植物防御中的结构生物学！Journal of Biological Chemistry | 深度解读植物免疫系统的分子基础！）。已有研究表明TNL的TIR结构域具有促进细胞死亡所需的寡聚依赖性NAD酶活性，但是尚不了解TIR结构域之间的相互作用如何使其具有催化活性。

2020年12月4日，国际顶级期刊Science发表了美国加利福尼亚大学伯克利分校Brian J. Staskawicz教授和Eva Nogales教授团队的最新相关研究成果，题为Structure of the activated ROQ1 resistosome directly recognizing the pathogen effector XopQ的研究论文。

ROQ1（对XopQ1的识别）-XopQ（黄单胞菌外蛋白Q）复合物结构是一种结合到病原菌底物上的免疫受体，被用作模型来研究直接结合，寡聚和TNL 的TIR结构域活化的机制。ROQ1已显示与Xanthomonas效应蛋白XopQ发生物理相互作用，导致其寡聚并触发TIR依赖性超敏细胞死亡反应（Nature子刊 | 最新研究揭示茄科植物中保护性诱饵蛋白酶及其受体的进化！塞恩斯伯里实验室Sophien Kamoun课题组解读植物如何诱骗病原菌）。本研究从ROQ1的本地宿主Nicotiana benthamiana中共表达，提取和纯化了组装好的ROQ1-XopQ复合物，并通过低温电子显微镜对其结构进行了解析，其分辨率为3.8-A。体内突变分析进一步证实了结构中描述的相互作用。

图1. ROQ1激活的机制

结果

本研究的结构揭示了ROQ1在识别XopQ后会形成四聚体抗病小体。LRR和一个称为C-JID的LRR后结构域形成一个马蹄形支架，在病原菌效应蛋白周围卷曲，从而识别底物的多个区域。ROQ1 LRR与XopQ的结合是通过表面暴露的残基构成结构域的支架，以及在两个LRR之间形成一个狭长的环，在相互作用位点形成一个小型的两亲和的a-螺旋。C-JID对底物的吸附方式与免疫球蛋白结合抗原的方式相似。与抗体的互补决定区相似，从C-JIDβ-三明治结构出现的互连环与XopQ形成底物特异性接触。特别是，C-JID的延伸环进入XopQ的活性位点裂缝，并与核苷结合所需的保守残基相互作用，这表明ROQ1不仅识别其底物，而且抑制了其配体结合功能。

图2. ROQ1-XopQ复合体的整体结构

图3. 结合到XopQ的ROQ1 LRR和C-JID（PL域）的结构

图4. NB-ARC域之间的低聚界面

核苷酸结合结构域（NBD），螺旋结构域1（HD1）和有翼螺旋结构域（WHD）因其在Apaf-1，R蛋白和CED-4（ARC）中的存在而被称为NB-ARC负责ROQ1在ATP结合状态下的低聚反应。各个前体的插入方式与在其他NLR结构中发现的方式类似，从而促进了N端TIR结构域之间的缔合。TIR域通过两个不同的界面（称为AE和BE）彼此结合，从而导致它们形成二聚体的二聚体。BE界面接触会在TIR域活性位点的外围（称为BB环）中引起构象重排，该环会暴露假定的催化谷氨酸盐（可能裂解NAD⁺）。这些结果为先前确定的TIR域NADase活性的低聚依赖性提供了理论依据。

图5. TIR域接口和BB环的构象重排

结论

本研究根据活化复合物的结构和以前的生化研究提出了ROQ1免疫信号传导的分步机制。ROQ1的LRR和C-JID通过与其表面和活性部位残基的直接接触来识别病原菌效应蛋白。底物的检测释放了NB-ARC域和LRR之间的自抑制性接触，从而使NB-ARC域转变为ATP结合的低聚倾向状态。复杂的组装使TIR域紧密接触，从而导致NADase活性位点以依赖于界面的方式开放。TIR结构域对NAD⁺的切割导致释放出腺苷二磷酸核糖，该信号分子触发胞质Ca²⁺内流，Ca²⁺内流是一种对各种生物和非生物胁迫产生响应的广泛使用的化学提示，导致下游激活局部细胞死亡和抗病性。

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