浙江大学高长有教授课题组：仿病毒形貌和成分的自组装纳米粒子促进胞吞并提高癌症治疗效果
The following article is from GIANT journal Author 《Giant》编辑部
浙江大学高长有教授课题组制备了具有仿病毒形态和成分的纳米颗粒，作为纳米平台用于促进细胞吞噬，并在体内实验中达到较高的治疗效率。通过一种新颖的pH响应性分解诱导自组装方法，再通过连接Tat穿膜肽和脂质修饰，获得了形态和组成类似于病毒的纳米粒子。这种粒子在增强细胞吞噬中显示出显著优势。将近红外光敏剂吲哚菁绿负载到这些纳米粒子中，证明了仿病毒粒子在体内和体外治疗传递和光热抗肿瘤作用中具有突出的能力。
图1. 示意图，显示了负载吲哚菁绿（ICG）的仿病毒纳米粒子（VM-T-L NPs）和对应的对照粒子的制备、结构、细胞吞噬和光热效应。VM-T-L NPs表面具有刺突结构和Tat /脂质功能分子，对于增强细胞吞噬和ICG传递具有优异的表现，可导致癌细胞死亡和肿瘤抑制。
病毒对细胞有很强的侵染性，其作用机理对纳米粒子的设计和细胞传递具有重要的启发意义。近年来，人工仿病毒粒子不存在病毒载体的安全性问题，被用作基因传递载体。目前，物理化学仿病毒纳米粒子的研究主要集中于具有表面结构的无机纳米粒子，例如表面粗糙的二氧化硅粒子或金属粒子等。同时仿病毒形貌和组成的纳米粒子结合了病毒的物理和化学特征，有望实现更强的细胞传递作用。但受制备材料和方法等所限，目前较少有成功报道。
本文亮点
1. 通过一种新颖的pH响应性分解诱导自组装方法和后续功能成分修饰，制备了具有仿病毒形态和组成的纳米粒子。
2. 以仿病毒纳米粒子作为传递载体，极大提高了细胞吞噬、药物传递效率和抗肿瘤作用。
1. 仿病毒形貌和成分的纳米粒子的制备
首先，通过乳化-交联法制备了壳聚糖纳米粒子。通过醛基与氨基间的Schiff碱反应将合成的2-醛基-5,10,15,20-四苯基卟啉（Por-CHO）接枝到壳聚糖纳米粒子中的壳聚糖分子上，得到壳聚糖接枝卟啉纳米粒子（CS-g-Por NPs）。将CS-g-Por 纳米粒子加入到pH 1盐酸中处理，通过Schiff 碱键分解和卟啉基团自组装，形成刺突形貌，获得表面粗糙的仿病毒形貌的纳米粒子（VM-NPs）。
利用VM NPs 中残留的戊二醛醛基与Tat 穿膜肽的氨基反应，将Tat 穿膜肽修饰到VM NPs，得到VM-T NPs。VM-T NPs 中，穿膜肽与壳聚糖共价相连，类似于病毒的糖蛋白结构。
通过VM NPs 表面的疏水性卟啉刺突结构修饰脂质1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）（~55 mol%）和胆固醇（~45 mol%），制备VM-L NPs。为利用Tat 穿膜肽和脂质的的协同作用促进胞吞，进一步模拟病毒化学组成，利用上述组成的脂质修饰连接Tat 穿膜的粒子VM-T NPs，得到VM-T-L NPs（图2）。
图2. 仿病毒纳米粒子的表征。（A-C）（A）平滑CS-g-Por NPs，（B）仿病毒纳米粒子VM NPs和（C）VM-T-L NPs的代表性TEM图像。比例尺：200 nm。插图是较高放大率的图像。比例尺：100 nm。通过将CS-g-Por NPs在0.1 M HCl中处理15分钟制备VM NPs。通过依次用Tat肽和HIV脂质修饰VM NPs制备VM-T-L NPs。不同NPs在水中的（D）大小和（E）zeta电位。
2. 仿病毒纳米粒子的胞吞
为研究仿病毒纳米粒子对胞吞的影响，选择HeLa 人类宫颈癌细胞、 HepG2人类肝癌细胞两种细胞系。通过与表面相对光滑的CS-g-Por NPs、CS NPs 对比，以及VM-T-L NPs、VM-T NPs、VM-L NPs、VM NPs 间对比，研究仿病毒形貌和组成粒子对胞吞的影响。实验结果表明，仿病毒形貌和组成的纳米粒子极易被细胞吞噬，类似于病毒对细胞具有很强的侵染性。仿病毒形貌的 VM NPs 相比于光滑纳米粒子 CS-g-Por NPs、CS NPs，可大大促进胞吞(图3)。粒子负载光敏剂吲哚菁绿ICG后，HeLa 细胞与HepG2 细胞对其胞吞与负载ICG 前类似（图4）。
图3. HeLa细胞对仿病毒纳米粒子胞吞的定量和定性分析。（A-D）流式细胞术检测结果显示，将FITC标记的纳米粒子与HeLa细胞在80 μg/mL的浓度下共培养1 h和3 h后（A，B），以及分别以20、40和80 μg/mL的浓度共培养3 h后（C，D），其胞吞率（A，C）和胞吞量（B，D）。数据表示为平均值±标准差，n =3，** p <0.01，在相同的实验条件下，VM-T-L、VM-T和VM-L NPs vs. VM、CS-g-Por和CS NPs。（E-J）HeLa细胞与VM-T-L NPs（E）、VM-T NPs（F）、VM-L NPs（G）、VM NPs（H）、CS-g-Por NPs（I）和CS NP（J）在浓度为80 μg/mL下共培养3 h后的CLSM图像。绿色、红色和蓝色分别代表纳米粒子、溶酶体和细胞核。
图4. 负载ICG的纳米粒子的表征以及HeLa细胞对负载ICG的纳米粒子吞噬的定量分析。（A，B）水中不同负载ICG纳米粒子的zeta电位（A）和大小（B）。（C，D）流式细胞术检测结果显示，在以80 μg/mL（ICG 负载量20 μg/mL） 分别共培养1 h和3 h后，其胞吞率（C）和胞吞量（D）。（C，D）中的数据表示为平均值±标准差，n=3，** p <0.01，在相同的实验条件下，VM-T-L@ICG、VM-T@ICG和VM-L@ICG NP vs. VM @ ICG、CS-g-Por@ICG和CS@ICG NPs。
3. 负载ICG仿病毒纳米粒子的体外光热治疗（PTT）效果
通过MTT 法检测负载ICG粒子对HeLa 细胞和HepG2 细胞的光热杀伤效果。结果显示，仿病毒纳米粒子促进了所负载的ICG 的细胞传递，光照下引起细胞内活性氧水平的急剧升高，从而增强了细胞毒性，对细胞起到杀伤作用（图5）。相同浓度下，按ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG、VM@ICG、 VM-L@ICG、VM-T@ICG、VM-T-L@ICG 的顺序，光热杀伤细胞的效果依次增加。例如100 μg/mL 时，VM-T-L@ICG 、VM-T@ICG、VM-L@ICG 细胞存活率分别只有14%、18%和20%；形成明显对比的是，相同条件下ICG、CS-g-Por@ICG 和CS@ICG 细胞存活率仍高达80%以上。
图5. 负载ICG纳米粒子的体外光热效应和光热治疗效果检测。（A）光照下（808 nm，1 W/cm2），负载ICG的纳米粒子和游离ICG的光热效应。（B-G）叠加的荧光和明场显微镜图像，显示HeLa细胞与浓度为100 μg/mL（ICG负载量25 μg/mL）的VM-T-L@ICG（B）、VM-T@ICG（C）、VM-L@ICG（D）、VM@ICG（E），CS-g-Por@ICG（F）和CS@ICG（G）共培养3小时，然后进行光照（808 nm，1 W/cm2，10 s）后ROS的产生。（H）HeLa细胞中ROS的相对浓度。数据为分析显微镜图像中荧光强度获得。（I）将HeLa细胞与浓度为75 μg/mL（ICG负载量18 μg/ mL）或100 μg/mL（ICG负载量25 μg/mL）的负载ICG纳米粒子和18 μg/mL或25 μg ICG共培养3 h，再分别光照（808 nm，1 W/cm2，30 s）或不光照后的细胞活性。（J）将HeLa细胞与100 μg/mL（负载量25μg/mL）负载ICG纳米粒子和25 μg/mL ICG共培养3 h，再进行光照（808 nm，1 W/cm2，30 s）或不进行光照后，凋亡检测结果。（H-J）中的数据表示为平均值±标准差，n =5，* p <0.05，在相同的实验条件下VM-T-L@ICG、VM-T@ICG和VM-L@ICG NPs vs. VM@ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG NPs和ICG。
4. 负载ICG仿病毒纳米粒子的体内光热治疗效果
利用带有HeLa 肿瘤的裸鼠进行了负载ICG 纳米粒子体内光热治疗研究。与其他各组形成鲜明对比的是，光照下VM-T-L@ICG 实验组在21 天后未发现肿瘤，说明肿瘤被完全清除（图6）。可以推断，当负载ICG 的纳米粒子注入到肿瘤中后，由于VM-T-L@ICG 纳米粒子能够显著促进胞吞，ICG 的细胞传递效率显著高于其他组。
图6. 负载ICG仿病毒纳米粒子的体内光热效应。（A）分别被指定处理并培养21天后，裸鼠中的肿瘤体积。数据表示为平均值±标准差，n = 5，** p <0.01，与其他组相比。“ L”代表激光照射（808 nm，1 W/cm2，5 min）。每组中的每只小鼠被注射指定的负载有25 μg ICG的纳米粒子或25 μg ICG。（B-E）Ki-67染色的从小鼠采集的肿瘤光学图像。小鼠用（B）VM-T-L@ICG+L、（C）CS-g-Por@ICG+L、（D）CS@ICG+L和（E）ICG+L 治疗后21天采集的肿瘤。（F）在808 nm激光照射不同时间下，VM-T-L@ICG、CS-g-Por@ICG、CS@ICG、ICG和生理盐水对荷瘤小鼠的光热效应。（G，I）CLSM图像和（H，J）CLSM、明场叠加图像，显示了VM-T-L@ICG纳米粒子（绿色荧光）在荷HeLa瘤小鼠体内向肿瘤中的渗透。（I）和（J）分别是（G）和（H）中矩形区域的相应放大图像。
该研究以Morphological and constituent viral-mimicking self-assembled nanoparticles promote cellular uptake and improve cancer therapeutic efficiency in vivo为题发表在《Giant》上。第一作者为张文博博士，目前在德国马普胶体与界面研究所从事博士后研究。通讯作者为高长有教授。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.giant.2020.100026
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