北京大学吕华课题组:蛋白质-高分子偶联物的精准设计--聚氨基酸化干扰素联合阿霉素用于肿瘤协同治疗
The following article is from GIANT journal Author 《Giant》编辑部
化疗药物和蛋白质药物是目前临床上肿瘤药物治疗的两种主要手段,并且两类药物的联合使用可产生协同增强的抗肿瘤功效。然而,化疗药物和蛋白质药物在药代动力学和生物分布等方面的巨大差异以及严重的药物毒副作用限制了传统联用治疗的应用。为了获得最佳的协同抗肿瘤功效,蛋白质-化疗药物-高分子(protein-drug-polymer, PDP)偶联物是一种简洁有效的药物联用策略,利用高分子材料共价偶联药物,形成药物共递送系统,并以可控的方式在肿瘤靶位释放出双重或多重药物。目前对PDP偶联物的设计和体内抗肿瘤研究甚少。
北京大学吕华课题组报道了一种位点特异且结构明确的多重响应性干扰素-聚硫辛酰肼阿霉素-聚氨基酸偶联物(IFN-PolyDox-PEP),用于肿瘤的联合药物治疗。作者巧妙地将蛋白质-聚氨基酸的定点偶联Grafting-to技术与原位冷冻聚合生长聚二硫化物的Grafting-from技术相结合,使不同种类的高分子材料在药物递送的各个阶段充分发挥作用。首先,聚氨基酸的修饰显著提升药物的半衰期,有利于更好地实现药物的肿瘤富集。随后,肿瘤微环境高表达的MMP酶介导的酶切释放出干扰素蛋白原药,提高干扰素对肿瘤细胞表面干扰素受体的结合力,充分发挥干扰素的抗肿瘤活性。进一步,聚二硫化物的特殊入胞机制和解聚性能促进了阿霉素的胞内递送和无痕释放(图1)。
图1.(A)IFN-PolyDox-PEP的合成示意图。(B)集MMP酶响应,酸响应和谷胱甘肽响应于一体,促进IFN和Dox靶向释放,实现蛋白质-化疗药联合用药,增强抗肿瘤协同效应。
本工作选用干扰素(IFN)和阿霉素(Dox)来构建PDP偶联物。首先通过基因工程技术在干扰素的N端引入基质金属蛋白酶(MMP)可裂解的氨基酸序列,利用自然化学连接技术将端基含苯硫酯的聚氨基酸与N端带有半胱氨酸的干扰素(Cys-M-IFN)反应,得到N端定点修饰的干扰素-聚氨基酸偶联物(IFN-PEP)。随后,利用干扰素的N端半胱氨酸残基上的活性巯基,通过冷冻聚合定点原位引发硫辛酰肼的聚合,得到干扰素-聚硫辛酰肼-聚氨基酸偶联物(IFN-PDS-PEP),并将阿霉素以酸响应的腙键共价连接到上述偶联物中,最终得到干扰素-聚硫辛酰肼阿霉素-聚氨基酸偶联物(IFN-PolyDox-PEP),并在溶液中自组装形成水合直径约为122 nm的壳核纳米粒子(图2A)。该纳米粒子中的阿霉素和干扰素药物分子的摩尔比高达103比1。
药物释放曲线结果表明,IFN-PolyDox-PEP 在模拟的正常生理环境(pH 7.4)下具有良好的稳定性,而在肿瘤微环境的弱酸性条件下(pH 6.0),腙键开始断裂,阿霉素的释放有所加速。肿瘤细胞内的高浓度谷胱甘肽(10 mM GSH)促进聚硫辛酰肼的解聚,使得纳米粒子发生剧烈瓦解,从而更大程度地促进阿霉素的释放(图2B)。
图2. (A) IFN-PolyDox-PEP的水合粒径表征,插图为TEM表征干态粒径。(B)阿霉素随时间的释放曲线。以不同PBS缓冲液模拟体内环境。
在抗肿瘤细胞增殖实验中,作者采用人卵巢癌 SKOV3细胞模型来验证干扰素/阿霉素联用的协同增强抗肿瘤作用。结果表明,相比于IFN-PEP或Dox的单一疗法,物理混合的IFN-PEP联合Dox用药(IFN-PEP+Dox)展现了更为优异的抑制肿瘤细胞生长的效果,证明了协同效应的存在。由于阿霉素的可控缓释,偶联物IFN-PolyDox-PEP的毒性相比于物理混合组略显温和(图3A)。
在细胞摄取实验中,IFN-PolyDox-PEP与细胞孵育2小时后,细胞内部产生弥散的荧光信号,表明偶联物相比于小分子Dox对照组,同样实现了在细胞溶胶内的大量富集,并且没有观察到明显的药物被束缚在溶酶体中无法逃逸的现象(图3B)。为进一步研究IFN-PolyDox-PEP的入胞机制,作者分别将SKOV3细胞用10 mM叠氮化钠预处理以抑制内吞作用或用5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)来封闭细胞表面的巯基(图3C)。结果表明,NaN3预处理的细胞对药物摄取没有显示出明显的下降(n.s.),而DTNB处理的细胞可抑制~25%的药物摄取(P <0.01)。上述实验结果表明,常规的内吞作用并不是IFN-PolyDox-PEP的主要入胞途径,而二硫键交换介导的细胞穿透可能是其潜在的一种入胞机制。
图3. IFN-PolyDox-PEP的体外细胞毒性和细胞摄取。(a)各组药物对卵巢癌 SKOV3细胞的抗增殖活性。(b)Dox或IFN-PolyDox-PEP在不同时间点的细胞摄取的CLSM图。细胞核以蓝色显示,Dox以绿色显示。(c)通过不同的预处理,SKOV3细胞对IFN-PolyDox-PEP的相对摄取量的流式细胞术表征。
最后作者通过荷瘤小鼠模型的抑瘤生长实验证明,相比IFN-PEP或Dox的单一疗法,物理混合的Dox+IFN-PEP联用能够明显抑制肿瘤生长,而IFN-PolyDox-PEP几乎完全抑制了肿瘤的生长(图4A),并且直到第27天都没有出现小鼠死亡(图4B)。H&E染色显示,与单独施用IFN-PEP或Dox相比,Dox + IFN-PEP和IFN-PolyDox-PEP组均引起更高程度的肿瘤细胞凋亡(图4C)。在本实验所采用的IFN和Dox的剂量下,所有治疗组的小鼠均未观察到明显的体重下降(图4D)。
图4. IFN-PolyDox-PEP的抗肿瘤效果。(A)各组药物抑制SKOV3肿瘤生长曲线。(B)小鼠生存率曲线。(C)各组肿瘤的H&E染色切片。(D)治疗期间的小鼠体重变化曲线。
总结来说,本论文立足于位点特异性蛋白质-高分子偶联物的简洁开发,实现了干扰素和阿霉素的联合递送,并通过肿瘤微环境响应实现可控药物释放,为聚氨基酸和聚二硫化物等高分子材料在抗肿瘤药物的联合应用提供了新的范例。
北京大学化学与分子工程学院2016级博士研究生王豪为本论文的第一作者,吕华研究员为通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划(2016YFA0201400)和国家自然科学基金(21722401)的支持。
原文链接:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666542520300436?via%3Dihub
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