上科大/深圳先进院钟超教授、上科大张辉教授《Adv. Mater.》：一种双层重组功能蛋白质水凝胶材料用于心脏贴片的制备

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近期，上海科技大学/深圳先进院钟超教授团队与上海科技大学张辉教授团队在制备蛋白质基水凝胶及拓展其生物医学应用方面取得新进展，以心脏补片为主要形式，探索了重组功能蛋白质水凝胶材料在心脏疾病方面（如心脏伤口止血修复、心肌梗塞缓释治疗）的治疗能力及效果。这种蛋白质基水凝胶不仅具有优秀的生物相容性、生物可降解性、组织粘性，还能够凭借自修复性质构建双层水凝胶材料，兼具各层功能特性（如与生物组织相匹配的机械性能、负载药物分子并实现较长时间的原位释放），为多层功能医用材料的构建开辟了新的道路。相关成果以标题为“A Bi-Layer Hydrogel Cardiac Patch Made of Recombinant Functional Proteins”发表在Advanced Materials（DOI：10.1002/adma.202201411）。上海科技大学物质科学与工程学院博士研究生蒋晓宇和生命科学与技术学院冯腾博士为论文的共同第一作者。此研究得到国家重点研发计划、国家杰出青年科学基金和国家自然科学基金联合基金的资助支持。

微创心脏贴片在生物医学中可作为止血敷料或是治疗心肌梗塞的材料，具有非常重要的临床意义，但对心脏贴片的开发仍然是一项重大挑战。通常来说，设计此类贴片需要同时考虑多种材料属性，包括生物吸收、无毒、与心脏组织的力学特性相匹配，以及能够在潮湿和动态环境中有效工作。通过基因模块化设计工程了一系列多结构域蛋白质，报告了一种可3D打印的双层蛋白质水凝胶贴片，用于治疗心力衰竭。如图1所示，利用水凝胶材料固有的自我修复特性，在物理上实现两个不同水凝胶层的无缝界面整合，并在功能上赋予心脏贴片各层的优势集成。利用双层水凝胶的生物相容性、结构稳定性以及可调节的药物释放等特性，他们展示了对两种小鼠心肌损伤模型具有止血、减少纤维化和心脏功能恢复的良好效果。

图1.双层水凝胶心脏补片的设计以及应用

图2. 蛋白质水凝胶的基因工程以及机械性能表征。a）构成基于ASP蛋白质水凝胶的基因模块化结构域。两个螺旋结构域，记为A和P，倾向于同源组装（A/A或P/P），而不是异质二聚化，作为凝胶形成模块。内聚模块（Mefp-3和Mefp-5，分别命名为3和5）源自海洋贻贝足蛋白。b）基于pET22b（+）载体的质粒构建。c）七块已成型的水凝胶照片，包括酪氨酸酶修饰前后以及共混的水凝胶。d）在频率扫描和振幅扫描（n=3）模式下对ASP和A35m水凝胶样品进行流变学测试。e）工程水凝胶剪切储能模量的比较（ω=10 rad·s⁻¹），应变=0.1%（n=3）。

图3. ASP系列水凝胶的自修复性能剪切变稀行为和自愈合特性，并通过3D打印制备ASP-A35m双层水凝胶。a）在一系列连续破坏恢复测量中观察到ASP和A35m水凝胶的自愈特性。在10 rad·s⁻¹的频率下测量G′和G〃（n=3）。b）通过3D打印制备各种设计形状的ASP系列水凝胶。c）ASP和A35m双层蛋白质水凝胶的自愈过程。d）刮刀上的双层水凝胶的数码照片（左）。冻干梯度水凝胶的SEM图（右）。e）在图（d）中相应部位观察到放大的SEM图。

图4. ASP-A35m双层水凝胶作为心脏补片。a）示意图显示了闭合小鼠左心室壁洞穿伤口的实验方法。制造了一个2 mm的洞穿伤口，并用心脏补片（直径5 mm）进行闭合。通过3D打印制备心脏贴片，然后贴在心外膜上。该贴片由两层水凝胶组成，其中一层较软，用于机械强度匹配，另一层较硬，用于抗爆裂压力。对照组为缝线缝合。b）比较代表性软组织、心肌组织和基于ASP的蛋白质水凝胶的杨氏模量。（n = 5。所有数据均为平均值±标准差。显著性在p < 0.05水平进行评估。ns，不显著；*，p < 0.05）。c）通过泵和数字压力计（顶部）进行空气泄漏试验，以及比较单独使用ASP和ASP-A35m双层水凝胶（底部）抗爆裂压力的能力。（n = 3）。d）将双层ASP-A35m双层水凝胶心脏贴片应用于出血部位的数码照片，显示其在0、4、7和28天后的生物降解。黄色虚线区域内的为贴片。e）伤口闭合后0、4、7和28天冻干水凝胶-组织界面的SEM显微照片。M，心肌组织。缝线组（n = 3）和ASP-A35m水凝胶贴片组（n = 3）在缺损闭合后7天和28天的代表性天狼星红染色（左）。比例尺：1 mm。缝合线组（n = 6）和ASP-A35m水凝胶贴片组（n = 6）的纤维化面积比率（右侧）由盲法病理学家评分。所有数据均以平均值 ± SEM表示，并使用未配对的Student t检验进行分析。在p < 0.05水平上评估显著性。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01。

图5. 用FSTL1负载的双层ASP-A35m水凝胶心脏贴片治疗可改善心肌梗死模型的心脏功能。a）实验设计示意图。将FSTL1（10 µg，以绿点表示）载入外层（50 µL A35m水凝胶，显示为深蓝色层）；然后将装载FSTL1的外层与内层水凝胶（50 µL ASP水凝胶，显示为浅蓝色层）融合。在急性心肌梗死后，将负载FSTL1的双层ASP-A35m水凝胶心脏贴片连接到受伤的小鼠心外膜，以原位释放FSTL1。b）通过Transwell设备对ASP、A35m和ASP-A35m水凝胶中FSTL1释放进行定性ELISA分析的方案（左）。PBS中释放的FSTL1的标准化分数（每组10 µg）（右）（n = 3）。c）心肌梗死后7天，仅心肌梗死组（n = 6）、ASP-A35m水凝胶心脏贴片组（n = 6）、FSTL1负载的ASP-A35m水凝胶心脏贴片组（n = 6）、FSTL1注射组（n = 6）和假手术组（n = 6）的代表性天狼星红染色切片。比例尺：1 mm。显示纤维化区域分布的直方图（右）。d）在仅用MI（n = 7）、ASP-A35m水凝胶心脏贴片（n = 7）、负载FSTL1的ASP-A35m水凝胶心脏贴片（n = 7）、FSTL1注射（n = 6）和假手术（n = 7）组治疗的心脏上，对TNNI3（绿色）和pHH3（红色）进行免疫荧光染色。比例尺：100 µm。显示增殖心肌细胞的统计数据直方图（右），（箭头表示增殖的心肌细胞）。e）心肌梗死后第7天（n = 6）左室射血分数（EF）和缩短分数（FS）的定量分析。f）定量分析心肌梗死后第7天舒张末期（LVPWD）的左室质量和左室后壁厚度。（n = 6）。所有数据均以平均值 ± SEM表示，并使用未配对的Student t检验进行分析。在p < 0.05时评估显著性。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。

总之，他们通过模块化基因设计成功地生产了一系列基于亮氨酸拉链的蛋白质水凝胶，这些水凝胶具有可调节的成分和机械性能、并能够通过3D打印定制化制备材料。利用这些水凝胶的自愈特性，打印了一种双层 ASP-A35m 水凝胶，并将其用作一种新型心脏贴片来治疗两种心脏损伤小鼠模型，分别为透左心室壁穿刺模型和心肌梗塞模型。他们在两种模型中均证明了纤维化的减少和心脏功能的改善，水凝胶贴片具有替代缝合治疗的巨大潜力。此外，双层水凝胶材料已成功负载治疗分子，然后附着在心外膜上，延长原位释放，达到更好的治疗效果。此外，水凝胶材料表现出生物相容性、结构稳定性、可调节的机械性能和生物吸收性，因此代表了一种很有前途的新型生物医学应用水凝胶材料。未来，他们将尝试在兔子和猪等大型动物模型中评估这些水凝胶材料，探索在 MI 模型中观察到的明显抗纤维化作用是否也会在大型动物中表现出来。

原文链接

https://doi.org/10.1002/adma.202201411

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