近日，东华大学洪枫教授团队利用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）成功交联各向异性的细菌纳米纤维素（bacterial nanocellulose, BNC）和透明质酸（hyaluronic acid，HA），制备了一种新型复合人工角膜。通过考察不同浓度HA交联的BNC/HA复合膜的透光率、力学性能、保水能力和细胞相容性等性能的变化，评价了该BNC/HA复合膜在人工角膜移植中的应用潜力。值得注意的是，这是首次将具有各向异性力学性能的BNC应用于人工角膜。该成果以Preparation and Evaluation of Bacterial Nanocellulose/Hyaluronic Acid Composite Artificial Cornea for Application of Corneal Transplantation 为题，作为2023年度1月首页封面文章（图1 ）发表于美国化学学会的Biomacromolecules 上（DOI：10.1021/acs.biomac.2c01052）。
图 1 文章封面图
角膜是眼球最外层的透明组织，它帮助聚焦光线，保护眼睛的组织和结构。同种异体角膜移植是治疗角膜疾病的首选，但全球眼库资源严重短缺，全球尤其是发展中国家供不应求。 BNC除了常见的优异理化性质外，还具有一定的柔韧性和透明性，这使得其在角膜移植方面具有巨大潜力；同时BNC的形状可控，具有一定的顺应性，该顺应性可以使BNC很好地贴附于眼表，适应眼表的圆顶型形状。该课题组前期通过研究，自主开发的一款水平转鼓生物反应器（中国专利ZL201210014383.9）不仅极大地提高了BNC的生产效率，而且与传统的浅盘静态发酵技术相比，该转鼓动态发酵生产的BNC具有各向异性的力学性能和更高的透光率（Carbohydrate Polymers , 2019 , DOI:10.1016/j.carbpol.2019.01.072 )。然而，由于BNC在动态发酵过程中受到剪切力的影响，致使其网络疏松、力学性能较差；而且与天然角膜相比，其透明度也没有100%满足要求，因此现有BNC的性能尚不足以在人工角膜移植中应用。 HA具有优异的透明度、润滑性和保湿性，但其力学性能较差，体内易降解。为了解决HA存在的问题，一般使用化学交联延长HA在体内的寿命。BDDE具有优良的稳定性和在医疗器械中长达15年的安全使用记录，其交联原理是在弱碱性条件下，分子两端的环氧基优先与HA主链中最容易接近的伯醇反应，从而将HA分子链以醚键相连（交联反应示意见图2 ）。最近的研究表明将BNC和HA以BDDE交联后的复合膜在伤口护理方面具有巨大潜力。然而，经BDDE交联的BNC/HA复合膜尚未研究透明性和角膜细胞的相容性，也尚未开发作为人工角膜，其在眼部应用的可行性未知。 针对上述问题，东华大学洪枫教授课题组利用水平转鼓生物反应器获得各向异性力学性能的B NC 后，尝试不同浓度的HA，通过BDDE将BNC与HA进行化学交联，从而获得了BNC/HA复合膜（制备流程见图3 ）。
图 2 复合人工角膜的交联反应示意图
图 3 复合人工角膜制备流程图
该研究结果表明，在保证BNC三维纳米网络结构不变的情况下，HA的引入增加了纳米纤维的直径，膜表面孔隙变小（图4 ）；HA的引入也使BNC的透光率最大提高了40%，肉眼可清晰看到膜底部放置的东华大学彩色校徽（图5 ）；在BDDE的作用下，BNC−BNC、BNC−HA和HA−HA在复合膜中发生相互作用。醚键的存在使复合膜的最大拉伸强度在转鼓旋转方向和轴向上分别提高了2.1倍和2.7倍，复合膜的爆破压也有一定程度的提高（图6 ），同时复合人工角膜还具备一定的抗缝合性（图7 ），缝合最大力接近人羊膜的缝合力（0.11 N），这些性能在保持了转鼓生产的BNC的各向异性前提下进一步满足了临床对人工角膜的力学要求。对复合膜进行含水量和失水率测试，结果表明所有复合膜在保持高含水的状态下保水性能明显提高（表1和图8 ），这表明其能满足角膜在眼表的湿润要求。体外培养兔角膜基质细胞（RCSCs）的结果表明，所有样品均能支持RCSCs在其表面的黏附和增殖，细胞形态正常，材料具有良好的细胞相容性（图9 ）。以上结果均显示所制备的人工角膜不仅安全，而且能够满足临床对人工角膜的要求。 综上，采用水平转鼓反应器制备的各向异性BNC交联HA获得的复合膜，具有人工角膜应用的巨大潜力，其优异的光学性能和保湿性能满足眼科材料的基本物理化学性质。此外，从水平转鼓生物反应器中获得的新型BNC由于具有高透明度，未来还可以与具有抗菌能力的聚合物材料复合，从而制备一种适合于眼表修复的眼表敷料。利用转鼓反应器制备的新型BNC在眼科领域有着很好的应用前景，在角膜移植或眼表修复方面均具有很大的潜力。
图 4 不同浓度HA制备的BNC/HA复合膜的微观形态和纤维直径分布统计
图 5 不同浓度 HA制备的BNC/HA复合膜的光学性能 （ 图中东华大学 L OGO 的使用已获得 学校 代表批准） （ A） BNC/HA复合膜的透明度差异 ； （ B ） BNC/HA复合膜 透光率 。
图 6 不同浓度的 HA制备的BNC/HA复合膜的力学性能 （ A ） 拉伸强度 ；（ B ） 断裂 伸长率 ；（ C ） 旋转方向的应力−应变曲线 ；（ D ） 轴向的应力−应变曲线 ；（ E ） 爆破压
图 7 不同浓度的 HA制备的BNC/HA复合膜的 缝合强度 （ *：0.01 < P < 0.05，**：0.001 < P < 0.01，***：P < 0.001。单个直方图上方的*表示与BNC在同一方向上的 显著性 差异 ） 表1 不同浓度的 HA制备的BNC/HA复合膜的 含水量
图 8不同浓度的 HA制备的BNC/HA复合膜的 失水率
图 9 不同浓度 HA的BNC和BNC/HA复合膜中RCSCs的细胞相容性 （ A ） CCK-8 ；（ B ） 细胞存活率 ；（ C ） 生长在BNC和BNC/HA复合膜表面的RCSCs在 培养 1、3和5天后的荧光显微形态 ； （ D ） RCSCs在BNC和BNC/HA复合膜上培养1、3和5天后的FE-SEM图像 （ *：0.01<P<0.05 ， **：0.001<P<0.01，***：P<0.001，#：P>0.05 ） 论文第一作者为东华大学生物与医学工程学院硕士研究生罗宇桦 ，通讯作者为细菌纳米纤维制造及复合技术科研基地的洪枫教授 。该研究得到了国家先进功能纤维创新中心和海南省重点研发项目的资助。
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https://doi.org/10.1021/acs.biomac.2c01052
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