表观领域前沿技术文章盘点 —— DNA 蛋白互作技术助力医学研究

导语

表观遗传学囊括的研究方向十分广泛，包括表观遗传修饰动态变化、非编码 RNA 生成代谢和功能、蛋白核酸的互作等等。诺禾致源特别推出系列盘点，定期为大家梳理表观领域前沿技术应用文章。本期的文章盘点选取了 CUT&Tag 技术应用于肿瘤研究和染色质开放性的两篇高分文章，2019年 Steven Henikoff 课题组发表在 Nature Communications 上的文章首次提出了 CUT&Tag 技术，一经推出便受到大家的广泛关注^[1]。今年  Nature和 Nature Communications 更是发表了四篇实验article 文章都应用了 CUT&Tag 技术^[2-5]。后续的系列盘点如果大家有感兴趣的相关技术也可以在评论区积极投稿，我们会为热门评论读者送上神秘礼品~

细胞的许多生命活动都涉及 DNA 与蛋白质之间的相互作用，如：转录过程包含聚合酶和转录因子结合 DNA；染色质修饰需要“writer”修饰酶结合靶点修饰区域等。几十年来研究者们开发了一系列研究 -蛋白互作的方法技术，包括凝胶迁移实验、foot-printing assay 等，而高通量测序技术的发展更是极大地扩展了研究的筛选应用范围。2009年 Dominic 将 ChIP 与 NGS 结合，发明了 ChIP-Seq 技术，成为研究全基因组范围内特异性蛋白质 -DNA 互作的经典方法^[6]。首先对样本甲醛交联固定，超声打断基因组 DNA，而后利用特异性抗体进行免疫沉淀，后续解交联并纯化 IP 的 DNA 构建测序文库，并进行高通量测序。CUT&Tag 技术省去了 ChIP-seq 中 的甲醛交联步骤，在活细胞内使用靶标特异性一抗和 Protein A/G-Tn5 分离特异性蛋白 -DNA 复合体。尤其是 Tn5 转座酶在切割靶点 DNA 的同时加上接头，全面提升试验效率^[1]。我们将 CUT&Tag 和 ChIP-seq 的实验流程进行了一下对比：

后续介绍两篇应用 CUT&Tag 进行相关研究的高分文章。

CUT&Tag 应用于肿瘤研究

 文章：The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity^[3]

 期刊 ：Nature immunology（IF：23.53）

 时间 ：2020年3月

 研究思路 ：

文章通过数据分析、细胞模型和小鼠模型等实验揭示了磷酸酶 PAC1 通过调节染色质开放性、组蛋白乙酰化修饰等表观印记，抑制T细胞的功能，减弱宿主细胞免疫监视功能，促进肿瘤免疫逃逸的作用机制。

1）研究基因筛选

研究人员分析了 TCGA 中的数据，发现 PAC1 在功能耗竭的T淋巴细胞中显著上调，且 PAC1（DUSP2）表达较高的肿瘤患者，其预后较差。

2）PAC1 功能验证

通过细胞模型进行体外实验和小鼠模型实验，发现 PAC1 抑制 T 细胞增殖和效应功能。PAC1 的缺失增强 CD8+ T 细胞的效应功能，降低T细胞表面 PD-1 的表达，促进宿主抗肿瘤免疫应答，从而抑制肿瘤进展和转移。

3）调控机制研究

研究发现 PAC1 通过招募核小体重构和去乙酰化（NuRD）复合体，重塑T细胞的染色质开放性，特异性抑制下游效应性基因的表达，最终促进耗竭性T淋巴细胞的形成。

使用免疫沉淀和质谱分析方法，发现 PAC1 与核小体去乙酰化复合体 NuRD 的多个组分均存在蛋白互作。通过细胞实验发现 PAC1 的过表达选择性抑制了组蛋白 H3 和 H4 的乙酰化。

由于组蛋白乙酰化会影响核小体的构型和染色质可接近性，作者进行了表观多组学测序分析：

• ATAC-seq 技术发现 PAC1 的缺失增加了染色质开放性。

• ChIP-seq 结果表明 PAC1 影响 H3K27ac 修饰水平。

• CUT&Tag 技术进一步研究 NuRD 复合体的核心成分 CHD4 与 DNA 的结合谱，发现 PAC1 的缺失减弱了 CHD4 与 T 细胞效应子相关基因位点的结合功能，且 CHD4 的富集主要集中在转录起始位点及其附近。

 研究亮点：（1）研究团队使用 CUT&Tag 技术来分析 NuRD 复合物的核心成分 CHD4 与 DNA 的结合情况，发现敲除 PAC1 减弱了 CHD4 与 T 细胞效应因子相关基因位点的结合功能。CUT&Tag 技术相比于 ChIP-seq，具有信噪比高、细胞起始量低、操作简单等特点。（2）多组学联合。研究人员利用 ATAC-seq 技术研究染色质开放性，发现 PAC1 的缺失增加了染色质开放性。且 H3K27ac 修饰的 ChIP-seq 数据与 ATAC-seq 数据一致。
CUT&Tag应用于染色质开放性研究

 文章：Genome-wide chromatin accessibility is restricted by ANP32E^[2]

 期刊：Nature Communications

 时间：2020年10月

 研究思路：

文章主要关注染色质的开放性调控机制，使用两种细胞：小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维干细胞。H2A.Z通过精确定位于基因组的特定位点来改变染色质结构并实现其功能，但是H2A.Z突变体致死表型大大增加了研究难度。ANP32E蛋白与H2A.Z蛋白相互作用，且 ANP32E突变体内H2A.Z发生重新定位变化。

（1）作者比较了ATAC-seq、H2A.Z的ChIP-seq以及RNA-seq结果，发现H2A.Z的global定位与染色质的开放区域一致性很高，但是不同细胞类型的H2A.Z分布存在部分差异。

（2）为了确定H2A.Z的富集程度和分布位点是否影响染色质开放程度，作者引入了Anp32e-/-突变体。通过比较野生型和Anp32e-/-突变体的ATAC-seq和H2A.Z的ChIP-seq结果，确认Anp32e-/-突变在全局范围内提升了染色质的开放程度，并且H2A.Z在基因启动子区域的富集程度明显增高。

（3）为了鉴定ANP32E对染色质开放性的调节通路是依赖于H2A.Z，作者敲低了Anp32e-/-突变体内H2A.Z表达水平，发现染色质开放的改变表型被部分rescue。

（4）最终作者通过CUT&Tag等实验结果证明：ANP32E影响染色质重塑复合体蛋白与DNA的结合，进一步调控基因表达和生命体的发育和分化过程。

相信看到这里，各位都能感受到 CUT&Tag 的应用领域与 ChIP-seq 重叠度非常高，但是相对于 ChIP-seq 而言，CUT&Tag 具有很明显的技术优势，包括：信噪比高、灵敏度高、重复性好和细胞要求起始量更低。

对于 CUT&Tag 技术有更多兴趣的小伙伴们，可以点击文章底部“阅读原文”观看讲解视频，为您全面解析技术细节和样本处理建议。

小贴士

诺禾致源为您提供优质的CUT&Tag建库测序以及数据分析服务，目前已经积累了上百例项目经验。CUT&Tag可接收的样本包括人和小鼠的冻存细胞以及冻存组织。

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参考文献：

[1] Kaya-Okur, H.S., et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 1930.

[2] Murphy, K.E., et al., Genome-wide chromatin accessibility is restricted by ANP32E. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 5063.

[3] Dan, L., et al., The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity. Nat Immunol, 2020. 21(3): p. 287-297.

[4] Douse, C.H., et al., TASOR is a pseudo-PARP that directs HUSH complex assembly and epigenetic transposon control. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 4940.

[5] Liu, B., et al., The landscape of RNA Pol II binding reveals a stepwise transition during ZGA. Nature, 2020. 587(7832): p. 139-144.

[6] Schmidt, D., et al., ChIP-seq: using high-throughput sequencing to discover protein-DNA interactions. Methods, 2009. 48(3): p. 240-8.

产品研发部   闫 琦 | 文案

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