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多策略GWAS分析，不只有SNP
常规的全基因组关联分析（GWAS）一般基于单核苷酸多态性（SNP）与表型数据关联，筛选出与性状变异相关联的功能基因。近几年来单一 SNP 的分析已无法满足日益增长的科研需求，下面介绍几种不同策略的 GWAS 分析，希望对各位科研学者有所助益。
01
Hap-GWAS单倍型( haplotype )是共存于单条染色体上的一系列遗传变异位点的组合，其在染色体上形成的连续的、稳定的、几乎不被重组所打断的单倍型区域，称为单倍型块( haplotype block )。以单倍型块为基础，进行性状与基因的关联分析也是十分有效的关联分析方法。2021年水稻[1]文章中，鉴于传统 SNP-GWAS 存在假阴性，且在识别全部关联基因的局限性，该研究增加了 Hap-GWAS 分析进行更精确定位。材料选择：259份水稻测序策略：Illumina PE150，12.16x主要结果：显著关联 SNP 的 LD 区域内定位到一个 NLR 基因簇，通过 Hap-GWAS 进一步定位到了 OsRSR1 基因与该性状显著相关。技术路线：
02
SV-GWAS结构变异(SV)包括缺失、插入、倒位、易位等，是基因组变异的主要来源，大量研究已证实 SV 广泛存在于物种基因组内，且对表型影响广泛[2-3]。2021年桃[4]研究中，进行了全面的 SV 图谱的绘制，并通过 SV-GWAS 发现重要关联基因，弥补了 SNP-GWAS 的不足。材料选择：149份桃测序策略：Illumina PE150，31.52x主要结果：SNP-GWAS 分析得到多个与果形相关的强 SNPs 信号存在于“S”基因座，而基于 SV-GWAS 分析，鉴定出最重要的关联是在“S”基因座位置从27,959,880 bp到29,634,101 bp的1.67 Mb 杂合倒位，且包含了显著关联的SNP。该变异导致其邻近基因 PpOFP2 上调，形成扁平果形。技术路线：
03
PAV-GWAS物种基因组中除存在大量 SNP 外，还存在大量的存在/缺失变异（presence/absence variation, PAV），PAV 变异最多可达基因组的六分之一，对物种基因功能存在一定影响，如防御反应、信号转导反应、应激反应等。如甘蓝型油菜[2]的研究中，PAV-GWAS 鉴定了与角果长度、种子重量和开花时间相关的结构变异，而 SNP-GWAS 未检测到这些结构变异，表明 PAV-GWAS 与 SNP-GWAS 在鉴定性状关联方面是互补的。材料选择：15个RIL家系样本，16个新建家系材料测序策略：Illumina + PacBio主要结果：同时使用 SNP-GWAS 和 PAV-GWAS 两种关联方法，发现 SNP-GWAS 的显著关联结果，并未落到靶基因 bnaa9.cyp78a9 的调控区域或编码序列中。而PAV-GWAS 直接检测到插入在 bna9.cyp78a9 启动子区上游的 3.9 kb 的 TE 元件，并确定为角果长度和种子重量性状相关变异。技术路线：
04
CNV-GWAS拷贝数变异（copy number variation ,CNV）是指基因组上某些大片段的拷贝数增加或减少，可分为缺失（deletion）和重复（duplication）两种类型。CNV 可通过改变基因剂量和转录结构等来调节有机体的可塑性，是个体表型多样性和群体适应性进化的主要遗传基础之一。绵羊[6]研究中，利用 SNP 和 CNV 分子标记相结合，挖掘了一系列与重要外形和农业性状相关的候选基因。材料选择：232个绵羊及16个野羊材料测序策略：Illumina PE150，25.7x主要结果：利用 SNP-GWAS 分析，获得多个与产仔数、乳头数性状显著关联基因，而 CNV-GWAS 分析又补充了新性状关联基因，如 GPC5。技术路线：
05
k-mer-GWAS常规 GWAS 分析方法是利用测序数据比对参考基因组来完成遗传变异的检测,在基因组组装效果不理想的情况下，可以通过相互比较来自不同样本的恒定长度k的序列（称为k-mers）集，来识别更广泛的遗传变异类型，如 SVs 等。Voichek[7] 等人基于 k-mer 的 GWAS (rfGWAS)方法，对拟南芥、番茄、玉米等2000个性状进行关联分析，建立 k-mer 与表型的直接关联，后再推断相关序列的基因组背景，进而发现更广泛的基因变异，甚至是组装缺失部位的变异信息。材料选择：1135份拟南芥数据，150份玉米数据，246份番茄数据测序策略：Illumina，6x 以上主要结果：如在拟南芥的 GWAS 分析结果中，显著关联 SNP 与 k-mer 处于同一 LD 中，比例为73%（LD≥ 0.5），说明了 k-mer-GWAS 的可行性。而幼苗萌发率的关联结果中，SNP-GWAS 无显著关联，而 k-mer-GWAS 发现显著关联 k-mer，该 k-mer 未比对到参考基因组中，通局部序列组装和同源比对发现一个位于 bZIP67 转录因子的3’UTR 区域的 SV。技术路线：
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参考文献：
[1]. Aijun W,Xinyue S,Xin J, et al. Identification of rice (Oryza sativa L.) genes involved in sheath blight resistance via a genome-wide association study[J]. Plant Biotechnology Journal.2021.[2]. Z_mienkoA, SamelakA, KozłowskiP, etal. Copynumber polymorphism in plant genomes[J]. Theor Appl Genet. 2014.[3]. Gaut BS, Seymour DK, Liu Q, et al. Demography and its effects on genomic variation in crop domestication[J]. Nat Plants. 2018.[4]. Guan J, Xu Y, Yu Y, et al. Genome structure variation analyses of peach reveal population dynamics and a 1.67 Mb causal inversion for fruit shape[J]. Genome Biology, 2021.[5]. Jia-Ming S, Zhilin G, Jianlin H, et al. Eight high-quality genomes reveal pan-genome architecture and ecotype differentiation of Brassica napus[J]. Nat Plants. 2020.[6]. Li X, Yang J, Shen M, Xie XL, Liu GJ, et al. Whole-genome resequencing of wild and domestic sheep identifies genes associated with morphological and agronomic traits[J]. Nat Commun. 2020.[7]. Yoav Voichek, Detlef Weigel. Identifying genetic variants underlying phenotypic variation in plants without complete genomes[J]. Nature Genetics.2020.
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重测序研究部 杨阳 | 文案