今早，小编被一条来自弗雷赛斯最新发布的消息给轰炸了：小编赶紧去核查情况。因为Science的这篇铜死亡是非OA订阅模式，所以小编手头仅有该文章的pdf版本，并无法从官网直接下载原图。
据悉这个图片查重中使用的是免费在线图片查重系统Figcheck，小编也登入该系统对据称出现图片重复的figure 4 C进行核查。因为直接从pdf中复制出来的图片是不含有尺寸标尺的，所以小编仅查看了该AI查重网站提供的检查结果图与标记尺选项。
为了方便大家比对，小编特意将相似度最高的边缘区域裁剪制作了如下的对比图：
是不是真的特别相似呢？质疑者表示这应该是使用的连续切片，所以导致的高相似度。依然有网友对此表示怀疑，细心的小编特意去查询了原文，看看文中是怎么说的：
(B) A tissue microarray of non–small cell lung carcinoma (NSCLC) (n = 57) was stained with lipoic acid (LA), and FDX immunohistochemistry (IHC) and expression was scored semiquantitatively by two pathologists (S.C. and S.S.), showing a strong direct correlation between LA and FDX expression (mean ± SD; p < 0.0001). (C) Representative cases of NSCLC with correlated low (top row) and high (bottom row) expression of LA and FDX1 by IHC.也就是说实验顺序是：先使用硫辛酸进行stain染色（处理），然后进行针对FDX1的免疫组化实验，之后病理学家S.C.和S.S.对FDX1的表达情况进行了半定量评分。C图中的图片是使用高浓度和低浓度硫辛酸的代表图片。
基本可以肯定，这个图片重复疑云就是一场单纯的只对图片进行相似度对比，而不考虑实际研究情况导致的乌龙。所以，AI查重虽然效率高，但假阳性的几率不小。大家都在毕业论文重复率问题上，对此有过深刻的体会。
当然，因为该论文是一篇非OA的文章，有非常多的朋友只是听说了这一消息，并未能阅读到该论文。之前曾经和大家一起讨论过新型的细胞死亡——NETosis的笔者决定对该论文进行解读与部分翻译，与各位分享一下这篇论文。如果你想了解有关于铜死亡更多的信息，请仔细阅读以下内容：曾今的新型细胞死亡——NETosis成为了今年国自然的新晋宠儿之一。最近笔者发现Science在Cell Death主题下发表了一篇来自美国Broad Institute of Harvard and MIT等单位合作的题为Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins的研究型论文，这篇文章里面作者提出了全新的死亡方式——铜死亡（Cuproptosis）。这可能是继铁死亡（Ferroptosis）之后又一金属离子相关的死亡方式。今天就让我们一起来看一下作者是怎么论证的吧！铜是所有生物体必不可少的辅助因子，但如果浓度超过进化保守的稳态机制维持的阈值，它就会变得有毒。然而，过量的铜如何诱导细胞死亡尚不清楚。在这篇文章中，作者在人类细胞中表明，依赖于铜的、受调节的细胞死亡不同于已知的死亡机制，并且依赖于线粒体呼吸。作者表明，铜死亡是通过铜与三羧酸(TCA)循环的脂酰化成分直接结合而发生的。这导致脂酰化蛋白质聚集和随后的铁硫簇蛋白质丢失，从而导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。铜作为必需酶的辅助因子的需求已在整个动物界得到认可，从细菌到人体细胞。然而，通过跨浓度梯度起作用的主动稳态机制将细胞内铜浓度保持在非常低的水平，以防止对细胞有害的游离细胞内铜的积累。尽管其他必需金属（如铁）的毒性机制已得到充分确立，但铜诱导的细胞毒性机制仍不清楚。铜离子载体是与铜结合的小分子，可将铜运送到细胞中，因此是研究铜毒性的有用工具。多条证据表明铜离子载体诱导细胞死亡的机制涉及细胞内铜的积累，而不是小分子伴侣本身的影响。结合铜的多种结构不同的小分子在数百个细胞系中共享杀伤谱（图1A）。结构功能关系实验表明，消除这些化合物的铜结合能力的修饰会导致细胞杀伤力丧失，而铜螯合消除了化合物的细胞毒性。尚未出现关于铜诱导毒性机制的清晰图景，相互矛盾的报道表明诱导细胞凋亡、不依赖半胱天冬酶的细胞死亡、活性氧产生，或抑制泛素-蛋白酶体系统。铜结合分子作为细胞死亡诱导剂的跨界功效表明它们靶向进化上保守的细胞机制，但这些机制尚未阐明。为了进一步确定铜离子载体的细胞毒性是否依赖于铜本身，作者分析了强效铜离子载体伊利司莫（Elesclomol）的杀伤潜力。细胞培养基中铜的来源是血清，因此，在没有血清的情况下生长的细胞对Elesclomol具有抗性。相比之下，Elesclomol的敏感性通过以1:1的比例添加铜完全恢复。铜补充剂同样使细胞对六种结构不同的铜离子载体治疗敏感（图1B），但补充其他金属，包括铁、钴、锌和镍，未能增强细胞死亡（图1B)。使用丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)消耗内源性细胞内铜螯合剂谷胱甘肽，使细胞对Elesclomol-copper诱导的细胞死亡敏感，而铜与四硫代钼酸盐(TTM)的螯合挽救了杀伤和其他金属的螯合剂没有效果。最后，使用强效铜离子载体（Elesclomol、双硫仑和NSC319726）进行2小时脉冲处理导致细胞内铜水平增加约5至10倍，但锌水平没有增加。这些结果表明铜离子载体诱导的细胞死亡主要依赖于细胞内铜的积累。那么铜离子载体介导的细胞死亡是否受到调节？特别是短期暴露是否会导致不可逆转的后续细胞细胞毒性？用浓度低至40nM的铜离子载体Elesclomol脉冲处理仅2小时导致细胞内铜水平增加15至60倍，超过24小时后引发细胞死亡（图1C）。该结果表明铜介导的细胞死亡确实受到调节。细胞死亡涉及信号级联和分子定义的效应机制，其中涉及蛋白质和脂质，例如细胞凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡和铁死亡的特征。以前的报道表明Elesclomol诱导ROS依赖性凋亡细胞死亡，但Elesclomol诱导的细胞死亡不涉及caspase 3活性的切割或激活（图1D&E)。同样，当细胞凋亡的关键效应子BAX和BAK1被敲除（图1F）或当细胞与泛半胱天冬酶抑制剂（Z-VAD-FMK和Boc-D-FMK）（图1G），Elesclomol仍能诱导细胞死亡，再次表明铜诱导的细胞死亡与细胞凋亡不同。此外，用其他已知细胞死亡机制的抑制剂治疗——包括铁死亡（ferrostatin-1）、坏死性凋亡（necrostatin-1）和氧化应激（N-乙酰半胱氨酸）——都未能消除铜离子载体诱导的细胞死亡（图1G），表明铜诱导的细胞死亡与已知细胞死亡途径不同的机制（图1H）。图1. 铜离子载体诱导的细胞死亡是非凋亡、非铁死亡和非坏死性凋亡对介导铜离子载体诱导的细胞死亡的途径的一个提示是观察到更依赖于线粒体呼吸的细胞对铜离子载体的敏感性是糖酵解细胞的近1000倍（图2A)。与对诱导铁死亡的GPX4抑制剂ML162的敏感性相比，用线粒体抗氧化剂、脂肪酸和线粒体功能抑制剂处理对铜离子载体的敏感性具有非常明显的影响（图2B）。此外，在电子传递链(ETC)的复合物I和II的抑制剂以及线粒体丙酮酸摄取抑制剂中，细胞死亡减弱，对铁死亡没有影响（图2B）。重要的是，线粒体解偶联剂FCCP对铜毒性没有影响，这表明铜诱导的细胞死亡需要线粒体呼吸，而不是三磷酸腺苷(ATP)的产生（图2C）。同样，在缺氧条件（1% O2）下生长的细胞减弱了铜离子载体诱导的细胞死亡，而在常氧条件（21% O2）下用HIF脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592强制稳定缺氧诱导因子（HIF）途径则没有（图2D），进一步强调了细胞呼吸在介导铜诱导的细胞死亡中的作用。然而，用铜离子载体处理并没有显着降低基础呼吸或与ATP相关的呼吸，但确实显着降低了呼吸的备用能力（图2E），这表明铜不直接针对ETC而是TCA循环的组成部分。为了支持这一点，Elesclomol脉冲处理的细胞的代谢物分析显示，Elesclomol敏感的ABC1细胞中许多TCA循环相关代谢物的代谢物失调呈时间依赖性增加，但在Elesclomol抗性A549细胞中则没有。这些结果建立了铜离子载体诱导的细胞死亡和线粒体代谢之间的联系，而不是ETC（图2F）。FDX1和蛋白质脂酰化是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调节因子
为了确定介导铜毒性的特定代谢途径，作者进行了全基因组CRISPR-Cas9功能丧失筛选，以确定与铜离子载体诱导的死亡有关的基因。为了最大限度地提高筛选的普遍性，作者专注于两种结构不同的载铜离子载体（Elesclomol和双硫仑的活性形式DDC）的交叉点（图3A~C）。通过敲除7个基因（图3A，以蓝色标记）挽救了这两种化合物的杀伤作用，包括FDX1（编码一种还原酶，已知可将Cu2+还原为其更具毒性的形式Cu1+，并且是Elesclomol的直接靶标)和六个编码硫辛酸途径的任一组分(LIPT1、LIAS、DLD)或脂酰化(PDH复合物，包括DLAT、PDHA1和PDHB）的基因（图3D）。这些观察结果通过一个独立的基因敲除筛选来验证（图3E）。此外，代谢酶筛选显示，复合物I的基因抑制也使细胞免于铜诱导的死亡（图3E），这与作者的发现一致，即ETC阻断铜离子载体介导的细胞死亡（图2）。个别基因敲除研究进一步证实，FDX1和LIAS的缺失赋予了对铜诱导的细胞死亡的抵抗力（图3F&G），进一步加强了FDX1和铜诱导的细胞死亡之间的功能联系。此外，FDX1缺失导致对许多铜离子载体（双硫仑、NSC319726、福美双、8-HQ和Zn-吡啶硫酮）的一致抗性），但对任一半胱天冬酶活化、凋亡诱导剂（硼替佐米、紫杉醇和拓扑替康）或铁死亡诱导剂ML162的效力均无显着影响。值得注意的是，铜介导的细胞死亡与FDX1表达和蛋白质脂酰化之间的紧密联系在高浓度Elesclomol（>40nM）下消失了，从而表明脱靶机制在这样的浓度下可能会发生细胞死亡，并可能解释文献中报道的相互矛盾的作用机制。此外，当细胞在糖酵解条件下生长时，大多数铜选择性化合物（Elesclomol、双硫仑和NSC319726）失去了杀伤活性，而具有更多混杂金属结合化合物（例如吡啶硫酮和8-HQ）则独立于代谢状态。这一结果与铜与线粒体代谢介导的蛋白质脂酰化的独特联系一致。图3. FDX1和硫辛酸基因是铜离子载体诱导的细胞死亡的关键介质蛋白质脂酰化是一种高度保守的赖氨酸翻译后修饰，已知仅发生在四种酶上，所有这些酶都涉及调节碳进入TCA循环的代谢复合物。这些包括DBT、GCSH、DLST和DLAT，这是PDH复合物的重要组成部分。已知这些蛋白质的脂酰化是酶促功能所必需的(图3D)。作者发现敲除FDX1或脂酰化相关酶可以拯救细胞免受铜毒性，这使作者继续探索FDX1是否可能是蛋白质脂酰化的上游调节剂。为了检验这个假设，作者进行了三项分析。首先，在癌症依赖图(www.depmap.org)中寻找协调依赖的证据。值得注意的是，FDX1和硫辛酸途径的组分在它们整个细胞系组中的活力效应高度相关（图4A）。其次，对208个人类肿瘤标本进行了硫辛酸染色和FDX1免疫组织化学实验，发现FDX1和脂酰化蛋白的表达高度相关（图4B&C以及图6A-D）。第三，使用硫辛酸特异性抗体作为DLAT和DLST脂酰化的量度来确定FDX1敲除是否影响蛋白质脂酰化。FDX1敲除导致蛋白质脂酰化完全丧失（图4D），并且还导致细胞呼吸显着下降，与LIAS敲除相似（图4E）。此外，FDX1缺失后的代谢物分析导致丙酮酸和α-酮戊二酸的积累和琥珀酸的消耗，由于PDH和α-酮戊二酸脱氢酶的TCA循环受到抑制，蛋白质脂酰化受到损害(图4F)。同样有趣的是，观察到硫辛酸途径中LIAS的关键底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的增加，这与FDX1是以前未被识别的蛋白质脂酰化上游调节剂一致。上述实验建立了铜毒性和蛋白质脂酰化之间的联系，但没有建立直接的机制联系。作者假设铜可能直接与脂酰化蛋白质结合，观察到铜结合游离硫辛酸，测得的解离常数为10-17，这表明了这种可能性。为了验证这一假设，从细胞裂解物中纯化了DLAT和DLST，发现这些蛋白质与带铜的树脂结合，但不与钴或镍树脂结合（图5A）。当敲除FDX1消除蛋白质脂酰化时（图4），DLAT和DLST不再与铜结合（图5B），表明硫酰部分是铜结合所必需的。图5. 铜直接结合并诱导脂酰化 DLAT 的寡聚化作者注意到，铜与脂酰化蛋白质的结合并不仅仅导致功能丧失，因为蛋白质的缺失挽救了铜离子载体治疗。作者提出铜与脂酰化TCA循环蛋白的结合导致功能的毒性增益。有趣的是，作者发现铜与脂酰化TCA循环蛋白的结合导致DLAT的脂酰化依赖性寡聚化（图5B&C）。类似地，Elesclomol敏感细胞的处理增加了DLAT寡聚体和可溶性DLAT的水平，而Elesclomol不敏感细胞系或FDX1敲除(FDX1KO)细胞的处理仅在高得多的浓度下导致DLAT寡聚化（图5D&E)。用强还原剂TCEP处理并煮沸消除了DLAT的低聚形式，表明寡聚体是二硫键依赖性的。通过免疫荧光证实了这些发现，观察到通过短脉冲Elesclomol处理对DLAT病灶的显着诱导，其中这种病灶在脂酰化缺陷的FDX1敲除细胞中减少（图5F~H）。这些发现支持了一种模型，其中在暴露于铜离子载体后，脂酰化蛋白质功能的毒性增益至少部分是由它们的异常寡聚化介导的。质谱分析还显示，铜离子载体处理导致Fe-S簇蛋白（图6A&B）以FDX1依赖性方式（图6C）以及诱导蛋白毒性应激（图6B&C)。这些发现与在细菌和酵母中观察到的铜会使含Fe-S的蛋白质不稳定一致。这种Fe-S簇蛋白的丢失是否有助于铜离子载体死亡表型仍有待确定。图6. 化学和遗传诱导的铜依赖性细胞死亡的共同机制至此描述的实验使用铜离子载体来克服通常使细胞内铜浓度保持在低水平的稳态机制。这些机制包括铜输入者SLC31A1(CTR1)和铜输出者ATP7A和ATP7B，它们分别由在铜失调综合征Wilson’s disease和Menke’s disease中发生突变的基因编码(图6D)。为了探索与铜离子载体治疗相关的铜毒性机制是否与这些自然发生的铜稳态障碍共有，作者检查了三个实验模型。首先，在HEK 293T和ABC1细胞中过表达SLC31A1，这显着增加了对生理铜浓度的敏感性（图6E）。与在野生型细胞中使用铜离子载体的研究结果一致，铜补充导致参与线粒体呼吸的蛋白质总体减少，蛋白质脂酰化减少，Fe-S簇蛋白水平降低，以及HSP70水平升高（图6F）。图6. 化学和遗传诱导的铜依赖性细胞死亡的共同机制重要的是，在过表达SLC31A1的细胞中，铁死亡、坏死性凋亡和凋亡抑制剂并不能阻止铜诱导的细胞死亡（图6G），而铜螯合剂、FDX1敲除和LIAS敲除各自部分拯救了铜诱导的细胞细胞死亡（图6G&H）。此外，天然细胞内铜伴侣谷胱甘肽的消耗导致铜依赖性细胞死亡，这可以在LIAS敲除后缓解（图6J）。最后，使用Wilson’s disease的小鼠模型，其中Atp7b缺失导致细胞内铜积累和细胞随着动物年龄的增加而死亡。比较老年Atp7b缺陷和野生型对照小鼠的肝脏，观察到脂酰化和Fe-S簇蛋白的损失，以及Hsp70的增加（图6K）。这些在铜毒性小鼠模型中的发现表明，铜超载导致的细胞效应与铜离子载体诱导的细胞效应相同。总之，过量铜促进脂酰化蛋白的聚集和Fe-S簇蛋白的不稳定，导致蛋白毒性应激并最终导致细胞死亡（图6L）。铜是一把双刃剑，它是整个动物界酶的辅助因子，但即使是适度的细胞内浓度也可能有毒，导致细胞死亡。铜稳态的遗传变异导致危及生命的疾病，并且铜离子载体和铜螯合剂都被认为是抗癌剂。然而，铜过载导致细胞死亡的机制一直不清楚。在这里，作者已经证明铜毒性的发生机制不同于所有其他已知的调节细胞死亡机制，包括细胞凋亡、铁死亡、焦亡和坏死性凋亡。因此，建议将这种以前未表征的细胞死亡机制称为铜死亡（Cuproptosis）。铜诱导的细胞死亡是由一种古老的机制介导的：蛋白质脂酰化。值得注意的是，已知很少有哺乳动物蛋白质被脂酰化，它们集中在TCA循环中，其中酶促功能需要脂酰化。作者解释了线粒体代谢和对铜介导的细胞死亡的敏感性之间的关系：呼吸、TCA循环活跃的细胞增加了脂酰化TCA酶（特别是PDH复合物）的水平，并且脂酰部分作为直接铜粘合剂，导致脂酰化蛋白质聚集，含Fe-S簇的蛋白质丢失，并诱导HSP70，反映急性蛋白毒性应激。作者在此描述的人类癌细胞中铜诱导的毒性目标（脂酰化和Fe-S簇蛋白）在从细菌到人类的进化过程中是保守的，这表明铜诱导的细胞死亡也可能被铜离子载体存在的微生物使用。天然合成并表现出抗菌活性。在铜稳态遗传性疾病（Wilson’s disease和Menke’s disease）的情况下，铜螯合是一种有效的治疗形式。然而，在癌症中，铜毒性的利用不太成功。铜离子载体，包括Elesclomol，已经在临床试验中进行了测试，但这种测试的发生既没有利用适当患者群体的生物标志物，也没有了解药物的作用机制。在黑色素瘤患者中，Elesclomol的3期联合临床试验表明，在这一未经选择的人群中缺乏疗效，但对血浆乳酸脱氢酶(LDH)水平低的患者的事后分析显示了抗肿瘤活性的证据。低LDH反映了细胞对线粒体代谢的更高依赖性（与糖酵解相反），这与作者的发现一致，即进行线粒体呼吸的细胞对铜离子载体特别敏感，并且这种敏感性可以通过其高水平的脂酰化TCA酶来解释。此外，作者观察到FDX1和脂酰化蛋白的丰度在多种人类肿瘤中高度相关，并且具有高水平脂酰化蛋白的细胞系对铜诱导的细胞死亡敏感，这表明铜离子载体治疗应针对具有这种代谢特征的肿瘤。因此，应考虑使用生物标志物驱动的方法进行铜离子载体的未来临床试验。