雨里：小分子药物发现的新技术和新思维

撰文 | 雨里

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2017年1月2日

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引子

2017年第一天，几个研究生同学小聚了一下。聚会上科学谈得少了些，但现在流行“不忘初心”的说法。20年前读研的初心正是从事小分子药物研发。依然记得很清楚，我的导师谢毓元院士给我布置的课题：找到既能抑制骨流失又能促进骨形成的双功能抗骨质疏松小分子药物。5年内，设计合成了将近200个化合物，也找到了体外双功能的化合物，但项目最终和大多数科研项目一样，以发文章和专利而结束。随后的博士后和工作经历就比较杂了，虽然也做了几年药物化学工作，但没有长期专注在这个领域。然而，作为一个“旁观者”，却给了我很好的观察角度。2017年第一篇随笔，分享一下我对小分子药物发现技术的观察和体会，也算是“不忘初心”。

正文

首先不得不说，现在小分子药物发现不算时髦。以PD-1单抗为代表的生物大分子风头正劲。火热程度也延展至国内。医药经济报的一篇文章分析了CDE公开的数据，截至2016年10月，国内进入临床申报的抗体类药物达到180个。甚至有人喊出了小分子这面红旗还能打多久的问题。其实，这种担忧是多余的，是因为缺乏对两种药物形式的了解。而且，最近几年，小分子药物发现的新技术发展也很快，必然带来药物研发的全新思维。

小分子和大分子两种药物形式的比较

我们先来看看小分子和大分子两种药物形式的比较。如下表所示，他们有各自的优缺点。小分子作为传统药物，可以口服，能够进入细胞内作用于胞内靶点，但一般难以作用于蛋白相互作用。而大分子药物，一般作用于细胞表面的靶点，抑制蛋白相互作用，特异性强，但一般不能口服，难以进入细胞内。因此，两种药物形式是互相补充的，将来一定是齐头并进，共同发展。只是大分子药物比较新，基数低，近年来发展迅速，给人造成“小分子是昨日黄花”的错觉。从市场份额来看，小分子仍是瘦死的骆驼比马大，占有率达70%。当然，细胞疗法、基因治疗、肠道菌活体药物等新药物形式，也正在兴起。加以时日，将会形成多种药物形式共存的格局。

药物	优点	缺点	发展趋势
小分子	可口服；多作用机制；成本低	难以作用于蛋白相互作用; 选择性低，容易产生副作用	传统药物；与其他药物齐头并进；
大分子	特异性强，可以作用于蛋白相互作用；副作用小，开发成功率高	难以口服，难以作用于细胞内靶点；研发生产成本高	今后10-20年迎来快速发展，成为主要药物形式之一
细胞治疗	干细胞，肿瘤CART等可以治疗无药可治的疾病。具有治愈的潜力	高成本；目前应用有限；商业化途径不明	快速发展，已有产品上市；大量产品处于临床；基础研究加速
基因治疗	CRISPR-Cas9；siRNA Viruses等靶向基因而具有治愈的潜力	高成本；目前应用有限；给药困难	快速发展，已有少数产品上市；基础研究加速
活体药物	肠道菌等调节宿主代谢，CNS，免疫等功能	目前应用有限；制造和给药，质量控制困难	起步阶段；已有产品进入二期临床

有意思的是，大分子和小分子的不足，正是各自药物创新的方向之一。比如，针对大分子不能口服的缺点，口服大分子药物成为制剂创新的前沿技术。前不久，以色列Oramed公司的口服胰岛素胶囊ORMD-0801二期临床取得成功，其中国权益5000万美元转让国内企业合肥生命科技。美国希望之城（City of Hope）医学院宣称发现了将单抗带入细胞内的技术，并转让纳斯达克上市公司Sorrento，引起投资者的广泛关注。小分子也不甘示弱，作用于蛋白相互作用的抑制剂（PPI）发展很快，成为热门方向。PD-1和PCSK9小分子抑制剂也是投资者和大公司特别关注的香饽饽。另外，小分子的缺点，作用不够专一，也可能转变成优点。比如，c-Met特异性单抗在临床都以失败而告终，而c-met小分子抑制剂Cabozantinib却能成功上市，其多作用机制带来的“君臣佐使”的效果，被认为是成功的原因之一。

小分子药物发现的新技术

我们知道，六七十年代药物发现主要是依靠细胞和动物模型，一般是表型筛选，经验的东西比较多。分子生物学包括结构生物学的快速发展，小分子药物发现进入基于分子靶点的时代。也就是，我们能够基于某个分子靶点进行高通量筛选，可以获得小分子和靶蛋白的复合晶体结构。药物设计，在计算机的帮助下，变得如此清晰和直接了当。因此，高通量筛选、虚拟筛选、基于结构的药物设计、以及先导化合物的优化成为小分子药物发现的常见技术。这些技术取得了很大的成功，今天仍然在不断丰富和发展当中。然而，药物发现的效率并没有如人们期待的那样大幅提高。人体生物是如此复杂，单一靶点的作用往往不足以达到治疗效果，而且靶点的验证必须通过临床试验。临床试验的代价和效率成为药物发现不可逾越的限速步骤。也正因为如此，药物发现新技术的意义在于三个方面：一是如果靶点是正确的，找到最有效的调控方式和分子；二是，尽早证明靶点是不可行的；三是，没有明确靶点时，找到有效的药物。本文根据文献和公开报道，总结了目前小分子药物发现的新技术。

常见技术的新发展	新概念（没有上市药物）
基于结构的药物发现 （SBDD）	蛋白动态 （Protein Motion）
基于碎片的药物发现 （FBDD）	蛋白降解靶向联合体 （PROTAC）
蛋白相互作用的抑制剂 （PPI）	小分子辅助受体靶向技术 （SMARTTM）
共价抑制剂 （Covalent Inhibitor）	基因转录模拟 （Transcriptional Mimetic）
变构抑制剂 （Allosteric Inhibitor）	氘代药物 （Deuterated Drug )
DNA编码化合物库 (DNA-encoded library)

常见技术的新发展

1.      基于结构的药物发现（SBDD）

对于一个药物化学家来说，最赏心悦目的画面莫过于蛋白的三维结构和小分子的复合晶体结构。基于结构的药物发现最具逻辑性，也最有成就感。最近的一个例子就非常有说服力。2016年9月《自然》杂志报道，美国和德国科学家基于μ鸦片受体（μOR）的结构，通过计算机虚拟筛选和设计，发现了不同于吗啡的小分子骨架，保持了激活Gi信号的麻醉作用，但避免了beta-arrestin调节的抑制呼吸系统的副作用(1)。为开发新一代镇痛药物提供了基础。

2.       基于碎片的药物发现（FBDD）

FBDD这个概念源于Brandeis大学Jencks在1981年提出的计算分子与蛋白结合Gibbs自由能变化的理论。一个由A和B两部分组成的分子，结合蛋白后Gibbs自由能的变化由A和B内在的能量变化，以及连接的能量变化，三部分组成。简而言之，A和B如果都能结合蛋白，以合适的linker连接在一起，整个分子的结合力会大大增强(2)。最早在实践中探索这个理论的是雅培的科学家。1996年他们在《科学》发表文章证明通过NMR方法可以鉴定两个结合在目标蛋白相邻区域的分子片断。随后，将两个片断连接可以得到高亲和力的分子(3)。FBDD有两个缺点，一是得到的小片断亲合力弱，而且没有选择性，可以结合很多蛋白；二是将两个碎片正确地连接非常有挑战性。因此大规模的优化设计仍不可避免。比如第一个由FBDD发现的药物Braf抑制剂Zelboraf (Vemurafenib) ，就是在起初发现的片断上，不断“生长”而成。这和传统的hit-to-lead没有太大差别。真正意义上，通过FBDD发现的药物，应该是Abbvie（前雅培）最近上市的明星分子Bcl-2蛋白相互作用抑制剂Venetoclax。他们通过N15核磁鉴定相邻片断，连接优化后得到了候选化合物Navitoclax和Venetoclax，最终Venetoclax成功通过临床试验(4)。

3.      蛋白相互作用的抑制剂（PPI）

对于小分子来说，蛋白相互作用以前认为是无法成药的，因为作用界面太大太浅。这也是大分子药物比如单抗相对于小分子的一个优势。然而近年来，人们发现通过调节蛋白构象或作用于界面上的“热点”区域等手段，小分子也能选择性抑制蛋白相互作用，特别是球形蛋白和一段多肽底物的作用。这个领域发展非常迅速(5)。2016年FDA仅批准10个小分子NCE药物，其中PPI占到2个，分别是前面提到的肿瘤药物Bcl-2抑制剂Venetoclax和干眼症药物lifitegrast。中国的生物科技公司亚盛（Ascentage）在这一前沿领域处于世界前列，研制的Bcl-2抑制剂，IAP抑制剂都已进入临床研究。2016年底，亚盛(Ascentage)宣布B轮融资5亿人民币，用于推进这些药物的开发，非常令人期待。

上市和后期在研的PPIs

药物	靶点	适应症	公司	状态
Venetoclax	Bcl-2	肿瘤	Abbvie	上市
AT-406	IAP	肿瘤	Ascentage	二期
LCL‑161	IAP	肿瘤	Novartis	二期
Birinapant	IAP	肿瘤	Tetrologic	二期
ASTX-660	IAP	肿瘤	Astex	二期
Idasanutlin	MDM2-P53	肿瘤	Roche	三期
AMG232	MDM2-P53	肿瘤	Amgen	二期
CGM097	MDM2-P53	肿瘤	Novartis	二期
Lifitegrast	LFA1–ICAM1	干眼症	Shire	上市
Tirofiban	αIIbβ3	凝血	Merck	上市
Carotegrast	α4β1	肠炎	Ajinomoto	三期
Apabetalone	bromodomain	动脉粥样硬化	Resverlogix	三期
GSK525762	bromodomain	肿瘤	GSK	二期

4.      共价抑制剂（Covalent Inhibitor）

共价抑制剂在六七十年代是毒性大的代名词，声名狼藉，人们避之唯恐不及。药物化学教科书也告诉我们要避免巯基（SH）、迈克尔受体、硝基（NO2）等活性基团。确实，许多药物因为这些基团，与体内蛋白反应产生毒性，肝毒尤为明显。有时这些小分子蛋白加合物甚至引发严重的免疫反应。然而，人们很少注意到的是，临床上有许多药物，起先是随机筛选得到的，但后来发现作用机制其实是共价抑制。其中包括历史上最伟大的药物阿斯匹林和盘尼西林，以及明星重磅炸弹药物比如氯吡格雷和奥美拉唑等。近年来，人们逐渐意识到共价抑制剂的优点，提出了靶向共价抑制（TCI）的概念。首先，降低活性基团，也就是共价抑制剂子弹头的活性；只有分子与目标蛋白非共价结合，保持合适的构象和位置，共价反应才能发生，从而达到高度选择性。共价抑制的过程可以是非可逆的，也可以是可逆的。即使非可逆抑制剂，由于目标蛋白可以重新合成，因此抑制作用仍然可以说是可逆的，只是周期取决于蛋白的合成速度。由于共价反应，即使分子与目标蛋白非共价结合的亲合力不够强，给予足够的时间，抑制作用仍能够达到完成。这样，分子不再受“配体效应”的限制，分子量很小的化合物，也能有很高的抑制活性。另外，低亲合力，长作用时间，非可逆等特点也不利于目标蛋白变异，从而减少耐药性出现的可能。正是由于这些优点，共价抑制剂现在成为热点，人们开始基于结构，合理设计这类药物，而且取得了很大的成功。我们比较熟悉的药物包括新一代EGFR抑制剂afatinib和AZD9291、Her-2抑制剂neratinib、 BTK抑制剂ibrutinib、其他肿瘤药物蛋白酶抑制剂carfilzomib、CYP17抑制剂abiraterone、丙肝药物蛋白酶抑制剂Telaprevir和Boceprevir等等(6)。这些共价药物中，由于耐药性的问题，激酶抑制剂尤其受到重视，而且都采用丙烯酰胺作为活性基团。这个结构当前是如此流行，以至于我的一个“两耳不闻窗外事”，做原料药外包的朋友有一天神秘兮兮地告诉我，他发现了一个奇怪的规律，就是最近的新药都有丙烯酰胺这个基团。巨大的化学空间中，一定还存在大量适合做共价抑制剂的基团，等待我们去发现和探索。

5.      变构抑制剂（Allosteric Inhibitor）

自然遵循经济性这一规律。人体生物也不例外。蛋白或酶都是多面手，在体内具有多种功能。而实现正确的时间、正确的地点、发挥正确的功能，除基因表达外，转录后通过蛋白修饰引起的构象变化也是最重要的调控手段。也就是说，每个蛋白都是一个变形金刚，根据需要，可以变化无穷。所谓变构抑制剂，就是特异性抑制蛋白构象变化，从而将其稳定在某个非活化或活化状态（inactive or active state）。这与传统的底物竞争性抑制剂比如ATP竞争性激酶抑制剂有所不同。最近，变构和共价相结合，又产生了更新的概念：那就是共价变构调节剂，完全模拟体内的表观修饰和信号调控，实现蛋白功能的控制。

变构抑制剂有什么优势？我非常喜欢“胖子”理论。也就是酶的底物比如ATP，与酶活性中心结合紧密，就像是一个大胖子坐在一把椅子上。而竞争性抑制剂要把这个胖子拉起来，需要更大的力气，也就是更高的亲合力。而变构抑制剂是在椅子的某处扎了一根针，胖子自己就跳起来了，并不需要多大的力气。举个不太恰当的例子，一个是暴力抢劫，另一个是顺水摸鱼。抢劫是容易遭到抵抗的，也就是容易产生耐药性。另外，蛋白的变构调节一般特异性比较强，而酶的底物一般适用于所有同家族的酶。因此，不易产生耐药性和选择性高成为变构抑制剂的两个优点。

变构抑制剂还能解决药物化学中的一些难点。最近就有两个很好的案例。一个是诺华2016年在《自然》上发表的SHP2小分子变构抑制剂。SHP2是PD-1信号通路下游的一个去磷酸化酶（phosphatase）。PD-1大热，其下游的靶点也成为关注的重点。然而，传统底物竞争性去磷酸化酶抑制剂一直难以成药。因为，竞争性抑制剂必然与含有磷酸基团的底物有类似性，因此极性大，难以穿透细胞膜。而诺华通过变构抑制得到了成药性很好的小分子(7)。

另外一个例子是KRAS的变构抑制剂。RAS是一种小GTPase，肿瘤中变异最多的基因之一，号称癌基因之王。然而，RAS的底物竞争性抑制剂，包括其他的GTPase抑制剂，非常难以发现。因为，GTP与GTPase的亲合力极强，一般在nM-pM之间，这个胖子没有人能够拉起来。美国科学家发现的小分子ARS-853与KRAS(G12C)共价结合，将其锁定在GDP结合的非活性状态而不能激活，因此达到抑制KRAS的效果(8)。

6.      DNA编码化合物库（DNA-encoded library）

DNA编码化合物库实际上是组合化学和高通量筛选相结合的一种形式(9)。最早于1992年美国著名的Scripps研究所的前所长Lerner教授提出这个概念。Lerner从单抗发现技术中得到灵感，在小分子上连接一段DNA，因此可以使用类似于噬菌体展示的筛选技术，找到与目标蛋白有高亲合力的小分子。这样大大提高了高通量筛选的效率。常规筛选需要每个化合物挨个筛选；　而这种方法，可以将成千上万的化合物放在同一溶液中，通过含有目标蛋白的载体，能与目标蛋白结合的分子就留下来了，只需DNA测序，就能知道化合物的结构信息，类似于扫描某个东西的条形码。得到的Hits，还可以进一步改造扩展，得到focused化合物库，进行第二轮筛选，反复多次，“进化”得到极高活性的化合物。听起来非常不错，但多年来也还未见有DNA编码化合物库产生的重磅炸弹药物上市。可能与组合化学一样，虽然可以产生海量化合物，但受合成技术制约，化合物的多样性受限。近年来，这项技术也不断发展比如多合成模块、化学多样性、DNA为模板的合成、双药效基团以及进化筛选等。学术界，哈佛大学的David Liu做了许多出色的工作。大公司中，GSK是最早的探索者。国内外DNA编码化合物库的生物科技公司的创始人几乎都来自GSK团队，包括国内知名的公司成都先导。GSK取得的成果也最多，比如GSK最近推向临床的，具有单激酶选择性的RIPK1变构抑制剂。著名的风投Atlas合伙人Bruce Booth 打造的公司Padlock，2016年被BMS 6亿美元收购。其核心资产，治疗关节炎的PAD4抑制剂，据说也是借用了GSK的DNA编码化合物库技术。最近，DNA编码化合物库的进化筛选技术，显示了发现替代单抗的，作用于蛋白相互作用的小分子的潜力。Nature Biotechnology专门报道了Sanofi和DiCE就这项技术的合作(10)。

新概念（没有上市药物）

1.      蛋白动态（Protein Motion）

2016年9月份，一则关于美国著名风投公司三石（Third Rock）的新闻引起人们的关注。三石的投资模式是自己培育公司，他们投资5.7亿美元建立了一家叫Relay的初创公司。这家公司利用先进的成像、结构生物学、大数据分析等技术，模拟细胞中的功能蛋白动态移动和构象变化。研究这些移动蛋白和其参与的细胞功能，可以鉴定新靶点，或者找到某个蛋白上合适的药物作用位点。如果说以前的蛋白结构是一幅静态的图片，这种技术产生的是一部动态的电影。其实，2016年6月份，另一家生物科技公司Morphic宣布了5150万美元的A轮融资，用于开发整合素（Integrin）抑制剂的开发。他们的策略与Relay非常类似，也是利用高分辨率的晶体结构研究整合素的移动和构象变化，并与著名的计算机辅助药物设计公司薛定鄂合作开发药物。值得一提的是，国内CRO公司尚华医药是其投资者之一。

2.      蛋白降解靶向联合体PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）

PROTAC这个技术从英文字面上理解，就是靶向蛋白降解的小分子联合体。联合体分子包括三部分：一头是靶向目标蛋白的结构；　另一头是可以招募蛋白降解体系比如E3 Ligase的结构；中间通过合适的linker连接。这与双特异单抗技术类似，可以算是双功能小分子。

诱导蛋白降解实际上不是什么新概念。临床上很多药物，意外发现具有降解靶蛋白的作用：比如抗肿瘤药物氟维司群（Fulvestrant）和他莫昔芬（Tamoxifen）可以降解雌激素受体；来那多胺可以特异性降解转录因子IKZF1和IKZF3。阿斯利康的第三代EGFR抑制剂AZD9291，临床上比其他T790M抑制剂疗效更好，也有证据表明，是因为它不但抑制酶活性，也选择性诱导EGFR T790M的降解。但这些意外发现没有普适性，也无法通过合理设计来发现。当然，降低蛋白的浓度，还有其他策略。比如RNAi和反义(anti-sense) DNA技术，通过沉默基因，减少蛋白的表达。这个方向一度十分热门，但由于药物传输等技术挑战，鲜有成功的案例。这一领域2016年却爆发了，FDA批准了两个反义药物：颇具争议的DMD药物eteplirsen和治疗SMA的罕见病药物nusinersen。所谓的基因剪刀CRISPR-Ca9技术虽然离药物上市还很远，但也成了明星中的明星，人们对此期待很高。另外一个抗肿瘤靶点HSP90，其实也是间接诱导蛋白降解。HSP90是伴侣蛋白，它的功能是帮助其他重要的信号蛋白正确折叠而稳定。一旦其功能被抑制，导致很多客户蛋白（client protein）被降解。目前有大量HSP90抑制剂处于后期临床阶段。

最直观的诱导蛋白降解的技术就是PROTAC。耶鲁大学的Craig Crews是这个领域中的先驱。但最早提出这一概念，是2001年UCLA Sakamoto实验室发表PNAS文章时提出的，Craig是作者之一(11)。在这篇文章中，设计了一个叫Protac-1的分子，通过招募泛素化蛋白beta-TRCP以Protac-1依赖的方式将目标蛋白amino peptidase-2(MetAP-2)降解，第一次清晰地展示了PROTAC的概念。除招募泛素化蛋白外，随后又发展了HyT（Hydrophobic tagging）技术。就是通过PROTAC技术，用大的疏水性基团比如金刚烷adamantane和Boc3Arg标记目标蛋白。蛋白降解机器将目标蛋白误认为没有正确折叠而予以降解(12)。

从科学研究的角度上，PROTAC是非常好的故事。然而，做药还有好多其他因素要考虑，比如化合物的理化性质等成药性指标。PROTAC分子不可避免地，分子量比常规小分子药物要大，虽然Linpiski规则也不是绝对的，但分子量太大成药的可能性减小是无法否认的事实。这就是为什么十六年过去了，还没有PROTAC药物上市，甚至鲜有化合物进入临床。当然，PROTAC也有本身的优势，比如，因为是event-driven的过程，所以化合物不需要与目标蛋白长时间和高强度的结合，因此可以靶向传统难以成药的靶点，比如表面缺乏小分子结合区域的蛋白；另外，这个过程类似于催化反应，抑制目标蛋白，并不需要等摩尔量的药物，因此获得极高活性成为可能。最后，在Craig等科学家坚持不懈地推动下，这项技术日益完善，最近取得了很大的进展，比如通过招募组织特异性的E3 Ligase获得高度选择性的PROTAC。正因为如此，PROTAC技术日益获得投资者和大公司的青睐，最近至少两个PROTAC公司获得大笔融资：2015年Craig的公司Arvinas B轮获4160万美元，并与基因泰克达成3亿美元以及默沙东4.3亿美元的合作协议；2016年哈佛大学和Dana-Farber的三位教授Ken Anderson, Nathanael Gray, 和James Bradner 创立C4 Therapeutic，首轮获7300万美元融资，并与罗氏达成7.5亿美元的合作协议。James Bradner还发现了BRD4抑制剂JQ系列化合物，并高调宣布放弃专利，引发极大关注。40出头的James后来成为诺华的研发负责人。C4的技术是基于2015年他们发表的《科学》文章，取了个名字叫Degronimid™，实际上就是PROTAC技术(13)。他们发现来那多胺等邻苯二甲酰亚胺类抗肿瘤药物，可以特异性结合E3 Ligase CRBN，通过PROTAC技术，可以选择性降解目标蛋白比如BRD4,活性达到pmole，并有很好的成药性。

3.      小分子辅助受体靶向技术（SMART^TM）

Warp Drive Bio 的SMART^TM 技术很多人不熟悉。但说到这个公司的创始人，也许大家看过新闻，　他就是2016年5月份加入药明康德风投基金，毓承资本的Gregory Verdine博士。Verdine博士是哈佛的教授，创立了多家生物科技公司，包括Warp Drive Bio。SMART^TM技术的全称是Small Molecule-Assisted Receptor Targeting，可以翻译为小分子辅助受体靶向技术。实际上，就是用小分子模拟体内伴侣蛋白的功能。小分子进入细胞后，首先和其受体结合，这个小分子蛋白复合物可以特异性抑制目标蛋白，小分子和其受体蛋白单独不能产生活性。说来有意思，这其实就是神药mTor抑制剂雷帕霉素的作用机制，由著名化学家，哈佛大学Stuart L. Schreiber教授于1994年发现。Schreiber在1988年发现了FKBP12，它与小分子配体FK506或者小分子免疫抑制药物形成复合物后，抑制去磷酸化酶calcineurin。1994年，发现雷帕霉素（Rapacicin）和FKBP结合的复合物可以抑制mTor信号通路。Warp Drive Bio公司宣称可以通过类似的技术，靶向一些难以成药的靶点比如RAS。但目前没有公开技术细节。2016年1月份，该公司宣布与赛诺菲为期5年总额为7.5亿美元的合作，想来他们的技术一定有独到之处。

4.      基因转录模拟（Transcriptional mimetic）

基因转录模拟这个概念实际上很难说得上是真正意义上小分子药物发现新技术或新概念。更多的是一种表型筛选技术。我们知道，有许多化合物，特别是天然产物，具有多种活性，没有明确的靶点。但不意味着这些化合物不能成药，有的还成了神药比如阿斯匹林和二甲双胍。而有的化合物比如雷公藤红素（Celastrol），也有各种活性，但运气就没有那么好了，由于毒副作用，难以成药。这种情况下，如果是基于靶点的药物发现，可以通过进一步改造化合物，减少副作用而解决问题。但对于没有明确靶点的化合物，就难以建立合适的筛选方法，或者不能通过构效关系来优化药物。基因测序和大数据技术的发展，使得我们可以经济快速地检测某个化合物对相关基因表达的影响。如果能够确定一组基因表达变化的指纹谱与某种疾病状态的相关性，我们就可以将这个基因表达谱作为筛选的替代读数（readout）。前面提到的Schreiber领衔的Broad研究所，建立了一个工具小分子基因表达谱数据库。因此，新化合物的基因表达谱可以与数据库中的化合物对比，如果基因表达谱类似，可以推测他们的活性也类似，或者作用于相同的信号通路和靶点。2016年9月份，哈佛大学的科学家在Nature Medicine上报道了Withaferin A调节瘦素敏感性的减肥作用(14)。此前他们发现雷公藤红素有减肥作用，但毒性太大。通过比较雷公藤红素代谢基因表达谱，在Broad研究所的数据库中发现了毒性更低的Withaferin A，具有类似的代谢基因表达谱和作用机制。

墨尔本大学的科学家在研究抗肿瘤药物来那多胺的免疫调节作用机制时，发现来那多胺对于有关基因的表达，与BET bromodomain抑制类似，比如下调cMYC和IRF4。有意思的是，随后他们发现，来那多胺分子中的一个片断NMP，也有类似的基因表达谱，且在动物模型的抗肿瘤效果与来那多胺类似(15)。NMP目前已进入临床研究。NMP是常见的有机溶剂，这让我想起，我博士后导师Breslow教授发现第一个HDAC抑制剂SAHA的故事，也是从DMSO意外发现的。许多药理实验使用各种有机溶剂，因此对数据的解读要非常小心，必须有严格的对照组。

5.      氘代药物(Deuterated Drug )

氘代药物就是将药物分子的氢元素（H）用氘（D）取代。由于H和D的细微差别，这种取代对活性的影响不大，但由于氘比氢重，形成的化学键断裂困难一些，因此对药物代谢可能产生很大影响，特别是处于代谢位点时。氘代药物在业界争议很大。很多人认为其创新性不足，是投机取巧。其实，氘代药物的研究1961年《科学》杂志就有报道(16)，而第一个美国专利出现在1970年。过去十年，以Auspex、Concert、Deuteria/DeuteRx为代表的公司，就已有药物的氘代申请了无数专利。以至于大公司在申请专利时，不得不将氘代化合物包括进去。人们对氘代化合物能否成药，还是抱有怀疑态度的。直到去年，Teva 32亿美元收购Auspex的舞蹈病治疗药物，氘代tetrabenazine（SD-809）时，人们才真正关注这个方向。Nat Rev Drug Discov 去年专门发文对此进行了介绍(17)。FDA因为杂质研究的原因推迟了SD-809的批准。然而，不出意外，2017年它将成为第一个上市的氘代药物。处于临床研究的氘代药物还有Concert的三个化合物：AVP-786（Dextromethorphan）、CTP-656（ivacaftor）和CTP-730（apremilast）。另外，Celgene、Vertex、 BMS和Pfizer等大公司也在开展氘代药物研究，比如Celgene的氘代lenalidomide，Vertex的氘代DNA-PK抑制剂VX-984， BMS的氘代NS3/4A抑制剂BMS-986144等等。国内开发氘代药物的公司包括苏州泽璟，他们开发的氘代索拉非尼已经进入三期临床。2016年10月，新闻报道成都海创开发的前列腺癌药物HC-1119，得到海思科的支持，进入临床研究。有消息称HC-1119可能为氘代恩杂鲁胺。

上述氘代药物，通过改变代谢，疗效或副作用都有改善，比如SD-809的副作用相比于Tetrabenazine大幅下降。对于国内市场而言，氘代药物可能还有绕开原研专利的作用，达到降低老百姓用药成本的目的。2016年，药政改革给业界带来许多利好消息。但年尾，中央媒体播出医生回扣的新闻，以及随后中央关于“两票制”改革的高调会议，透露出药品降价的强烈信号。因此，解决药物可及性问题成为国家战略，氘代药物也许会受到鼓励。

氘代药物在SD-809获批后，可能会受到更多重视。但仍然面临专利，成本以及氘代技术等问题。据说，如果氘代的纯度达不到98%以上，2%的原形药物就可能构成侵权。另外，技术上目前还缺乏高效的氘代方法，上述药物一般都是使用常见的氘代试剂制备而来。华人化学家George Li 创立的CombiPhos Catalysts，基于杜邦公司的技术，开发了系列高效的氘代催化剂，据说可以降低氘代药物开发的门槛，值得关注。

小分子药物发现的新思维

药物的治疗，就是药物调节人体异常功能的过程。现代基于靶点的药物创新，分为两个方面，一个是找到可调节的靶点，另一个就是找到执行调节功能的药物。发现新靶点，需要长期的基础研究积累，而且验证靶点也是一个长期和昂贵的过程。更为复杂的是，药物形式也可以决定靶点的成败。新的药物形式，或者是发现药物的新技术，看起来属于技术创新，但其性价比高，一旦形成突破，它会形成技术平台，可以开发一系列药物。中国的基础研究发展很快，但原创靶点的发现与欧美强国仍有差距。就学科来说，中国的有机化学水平应该不落后于任何国家，从事有机化学的研究人员数量全球第一。因此，在小分子药物发现技术创新上，我们具备了技术基础。我们需要的是创新的思维，以及多学科交叉，紧密合作的团队和机制。

上述提到的新技术，也不是谁独创的黑科技。大多数是基于已有成果，提炼而成。只是他们的思维不一样，多想了一层，找到了别人没有在意的逻辑。而这个思维和逻辑，就是来源于我们人体本身的调控过程。比如，某个靶点或者某个与疾病相关的功能，体内调控机制，是底物竞争来调节,还是变构和共价调控。我们比较竞争性，变构和共价抑制剂的优缺点，就会发现，符合自然规律那个调控总是最好的。动态蛋白技术，PROTAC和SMRT，基因转录模拟等新技术都是模仿体内的调控过程。带着这样的思维，我们去审视一些我们耳闻能详的事实，就会产生不一样的想法。

1.      紫杉醇的作用机制

比如，紫杉醇被写进了教科书，即使初出茅庐的研发人员，也能回答出紫杉醇的作用机制是微管蛋白（tubulin）的抑制剂。学习得深入一点，我们还知道，紫杉醇结合于微管的内侧beta-subunit上，稳定微管的聚合，因此阻止微管的解离而抑制细胞的有丝分裂。我们从微管的体内调控过程去思考，发现紫杉醇的作用机制至少包含两个我们没有注意的背后逻辑。

首先，微管蛋白（tubulin）实际上是一种GTPase，分为alpha和beta两个亚单位（subunit），微观的聚合和解离是一个由GTP和GDP交换控制的高度动态的过程。GTP结合的微管蛋白不断加到微观末端，稳定微管，微管不断延长。微管蛋白是GTPase，能够将GTP水解成GDP，释放一分子磷酸，GDP结合的微管蛋白构象发生变化，就从微管上解离下来，微管开始缩短。紫杉醇的作用机制就是抑制GDP结合的微管蛋白构象发生变化而稳定微观聚合状态。因此，第一个我们没有注意的逻辑就是，紫杉醇实际上是微管蛋白GTPase的变构抑制剂。

第二个有意思的事实是，虽然紫杉醇的作用机制被认为是稳定微管，但实际上紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡的浓度，远低于实际观察到的微管延长所需要的最低浓度(18)。也就是，紫杉醇起效并不需要1:1地抑制微管蛋白（tubulin），少量紫杉醇分子即可干预大量微管蛋白的动态过程。这就类似于PROTAC技术中提到的所谓event-driven药理，药物靶向一个事件。这种情况下，药物容易达到pmole级别的极高活性。确实，微管抑制剂的活性一般都比较高，除紫杉醇类化合物外，还有比如长春新碱，用于ADC的毒素美登素（Maytansine）等。Event-driven药理就是第二个我们没有注意的逻辑。

从这两个逻辑，我们至少能想到两个有意思的问题或创新的方向：现在的微管抑制剂，虽然作用位点不一样，但都是变构抑制剂，能不能找到GTP/GDP竞争性抑制剂或mimetics,干预GTP/GDP交换的微管动态调控过程；能不能找到其他的event-driven药理的靶点，得到高活性药物。

2.      PARP抑制剂

PARP是一种多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶，在DNA的修复当中有重要功能。PARP检测到有裂口的单链DNA（SSBs）后，与之结合，利用NAD+合成聚二磷酸腺苷核糖（PAR）链，作为信号，招募其他DNA修复机器。PAR链对PARP自身的修饰会诱导构象变化，从修复好的DNA上解离下来。修复完成后，PAR链被降解。SSB如果不能及时修复，DNA复制后，就会产生有缺陷的双链DNA（DSBs）。双链DNA的修复机器HRR (homologus recombination repair)包括BRCA等蛋白。PARP被抑制，细胞内会累积SSBs，进一步导致DSBs的累积，DSBs如果不能被HRR及时修复，细胞就无法生存。PARP和HRR功能同时丧失，导致合成致死。因此，PARP抑制剂最早被尝试用于治疗BRCA变异的肿瘤，比如BRCA阳性的卵巢癌和乳腺癌(19)。

PARP抑制剂在药物研发史上也算是个传奇。赛诺飞最早将Iniparib推至乳腺癌三期，但最终失败。直到最近才发现是一个乌龙事件，Iniparib并不是PARP抑制剂。好笑的是，因为赛诺飞的失败，Pfizer和Merck将自己的PARP抑制剂贱卖。2014年FDA批准阿斯利康的olanparib，用于BRCA变异的卵巢癌。PARP抑制剂一跃成为国内外研发的热点。2016年12月，FDA加速批准了第二个PARP抑制剂rucaparib。处于三期临床的还有Veliparib、E7016、Niraparib和Talazoparib。其中Niraparib和Talazoparib分别被恒瑞和再鼎引入中国。原研进口和国内自研拿到或等待临床批件的至少还有5家，临床前在研的应该还有一批，竞争非常激烈。

现在如果简单me-too一个PARP抑制剂，时机上有点晚了。但仔细观察PARP抑制剂的作用机制，却有一些值得思考的东西，也许能为创新提供思路。首先，当然是合成致死这一概念。替莫唑胺（temozolomide）和喜树碱（camptothecin）等化疗药物，导致SSBs大量累积，成为PARP抑制剂联合用药的最好搭档。另外，HRR基因除BRCA外，还有ATM、PALB2等，也可以成为合成致死的目标。FDA最近批准了olanparib的突破性资格，用于ATM和BRCA2变异的晚期前列腺癌。第二，精准医疗可以帮助PARP抑制剂扩大病人群体。现在病人的BRCA变异是生殖系突变（germline mutation），也就是正常细胞中也有这个变异，因此PARP抑制剂的选择性，实际上类似于化疗药物，利用肿瘤细胞快速分裂的特点，DNA复制频繁，出错的几率比正常细胞大。基因测序可以找到体细胞基因突变（somatic mutation），也就是变异是肿瘤细胞所特有的，这样不但扩大病人群体，还可以进一步提高药物的选择性和安全性。第三，非选择性PARP抑制剂。目前的药物都是PARP1和2的抑制剂，但对PARP5的选择性比较高。PARP5又叫tankyrase，曾经也是热门靶点，诺华做了大量工作。因为，tankyrase在WNT信号通路中有重要的功能，而WNT信号通路在结肠癌等肿瘤中经常高表达或变异。可惜，抑制WNT，对快速更新的肠道上皮细胞产生毒性。令人意外的是，第一三共的E7016是PARP和tankyrase的双重抑制剂，动物中却没有观察到肠道毒性。机制还不清楚，也许PARP抑制保护了肠道细胞的伤害。确实，PARP抑制剂对于心血管，中枢神经系统，自身免疫疾病都有保护作用，大量证据表明是通过调节Treg细胞起作用。

第四点是最有意思的，目前的PARP抑制剂虽然是NAD+竞争性化合物，但除了抑制酶的催化活性外，还能将PARP蛋白trap在DNA上，形成PARP-DNA复合物，原因是PARP被抑制后不能变构从DNA上解离。这个复合物，相当于靶向DNA的化疗药物，细胞毒性比抑制PARP酶活性还要大。这也解释了为什么PARP抑制剂在没有BRCA变异的肿瘤中也有一定的效果，以及各个化合物的抗肿瘤活性与其酶抑制活性不线性相关。研究发现，各个药物的PARP Trapping活性差异很大，大概顺序是talazoparib > niraparib > olaparib = rucaparib > veliparib。因此，talazoparib的抗肿瘤活性最高，但副作用也相对大得多，治疗窗口窄。PARP抑制剂在这里包含了几个新概念：既是竞争性抑制剂，又是变构抑制剂。还有前面提到的SMART技术，形成复合物后发挥效果。这对于小分子药物研发很有启发作用。至少靶向DNA的药物，可以照葫芦画瓢，开发类似的化合物，比如topoisomerases(TOP1)和DNA methyl transferase(DNMT)抑制剂等。

3.      ATP和GTP竞争性抑制剂

如果要问当前小分子药物研发什么方向最热门，无疑是激酶（kinase）抑制剂。国际上不说，至少国内的替尼大战，业界已经是人尽皆知。激酶抑制剂里最早，也是最大一类是ATP竞争性抑制剂，包括Gleevec等明星药物。发展共价和变构激酶抑制剂是创新的方向。但我们也可以回到最基本的化学，做一些思考。比如，你如果是学化学的，你会发现ATP和GTP的化学结构是如此类似。ATP作为底物的激酶，已经成为小分子药物发现最大的领域。GTP作为底物的GTPase也是最重要的信号通路调控机制之一，为什么没有GTPase竞争性抑制剂药物出现。是因为GTPase不能成药吗？有如前面提到，tubulin和RAS作为GTPase几乎是验证过的抗肿瘤靶点。这就要回到化学上来解释，因为GTP和GTPase的亲和力超强，一般在低nM和pM。前面介绍变构抑制剂时提到，非常难找到它的竞争性抑制剂。当然，发展变构抑制剂是打开GTPase这扇门的重要方向。但我们知道，化学发展到今天，就象人们常说的一样，已经没有我们不能合成的小分子。既然，GTPase能与GTP高亲合力结合，一定能够找到类似化合物与之竞争。我们可以想像，如果能找到这样的化合物，首先，化合物的活性必定极高，Kd可能达到pM级别。那另外一个问题就是，能不能找到具有选择性的化合物，比如只靶向RAS。理论上肯定是可能的，只要GTPase的活性中心有差异。即使没有选择性，化合物pM的活性，使其可以利用ADC技术克服选择性的问题。这是GTPase抑制剂令人期待的地方。激酶抑制剂最大的难点就是选择性。而GTPase抑制剂即可能单独成药，也可以作为ADC的毒素，项目的风险大大降低。有人可能会说，你这是纸上谈兵。但爱因斯坦说过，最不能忍受在木板最薄的地方钻孔。新药研发创新性极强，也许木板最厚的地方有另外一番天地。而且，可以负责任地说，GTPase竞争性抑制剂已经不是纸上谈兵了。

结语

小分子药物作为传统的药物形式，有其不可替代的优势。小分子药物创新当然受制于新靶点的发现。然而，PROTAC,、SMRT技术，甚至PARP抑制剂这样的新颖作用机制，让我们看到小分子药物发现，还可能通过新技术打开另外的天地。中国化学合成技术的领先地位，让小分子技术创新具有更好的基础。我们说，真正的颠覆性技术，有时不是设计出来的，而是“碰”到的。我们全球第一的化学合成队伍，在飞速发展的生物医药大环境下，出现任何黑科技也不是令人奇怪的事情。对于寻找创新项目的投资者或制药公司，如果忽视中国科学家的创造力，是十分短视的。2017年是十分令人期待的一年，让我们试目以待，也许中国的小分子药物发现会给世界一个惊喜。

参考文献

1. Structure-based discovery of opioid analgesics with reduced side effects. Nature. 2016 Sep 8;537(7619):185-190)

2. On the attribution and additivity of binding energies. Proc Natl Acad Sci U S A 78, 4046–4050

3. Discovering high-affinity ligands for proteins: SAR by NMR. Science 274, 1531–1534

4. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 2016 Nov;167:28-37

5. Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge Nat Rev Drug Discov. 2016Aug;15(8):533-50

6. The resurgence of covalent drugs. Nat Rev Drug Discov. 2011 Apr;10(4):307-17

7. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases Nature. 2016 Jul7;535(7610):148-52

8. Selective Inhibition of Oncogenic KRAS Output with Small Molecules Targeting the Inactive State Cancer Discov. 2016Mar;6(3):316-29

9. 20 years of DNA-encoded chemical libraries. Chem. Commun., 2011, 47, 12747–12753

10. DNA-encoded drug libraries come of age. Nat Biotechnol. 2016 May 6;34(5):450-1

11. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation .Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17;98(15):8554-9

12. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nat Rev Drug Discov. 2016，Nov 25th ,online

13. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science 19 Jun 2015:Vol. 348, Issue 6241, pp.1376-1381

14. Withaferin A is a leptin sensitizer with strong antidiabetic properties in mice. Nat Med. 2016 Sep;22(9):1023-32

15. The drug vehicle and solvent N-methyl pyrrolidone is an immunomodulator and antimyeloma compound. Cell Rep. 2014 May 22;7(4):1009-19

16. Effect of Deuterium Substitution in Sympathomimetic Amines on Adrenergic Responses. Science 13 Jan 1961:Vol. 133, Issue 3446, pp. 102-104

17. Deuterated drugs draw heavier backing. Nat Rev Drug Discov. 2016, 15, 219-221

18. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Review Cancer 2004, 4, 253-265

19. Laying a trap to kill cancer cells: PARP inhibitors and their mechanisms of action. Sci. Transl. Med. 8, 362ps17 (2016)，1-7

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作者：雨里

出处：【医药研发社交平台】（ID：drugsns）

编辑：Walker   配图：网络

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