6种国产新型冠状病毒核酸检测试剂检测性能比较与分析

郭元元，王昆，张宇，张文佳，王丽英，廖璞△

重庆市人民医院三院院区检验科

目的 对不同的新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂的检测性能进行比较和分析，以供实验室参考。
方法 收集该院1例弱阳性患者不同时间点采集的咽拭子标本，选取6种国产试剂（A~F试剂）平行检测，进行RNA提取和扩增，根据各试剂检测结果比较其性能。
结果 C和F试剂3次平行检测结果（ORF1ab和N基因）均为阳性，D试剂均未检出N基因，A、B、E试剂均有未检出ORF1ab情况存在；C试剂批内重复检测结果最佳；F试剂（N和ORF1ab）、E试剂（ORF1ab）和A试剂（ORF1ab）3次检测结果的CT值有趋势性变化。
结论 6种2019-nCoV核酸检测试剂对弱阳性样品的检测能力有差异，部分试剂的准确性、灵敏度及重复性欠佳，亟需进一步优化，提高其性能，以便更好地适应大规模的筛查需求。

目前，实时荧光RT-PCR检测2019新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸阳性是新型冠状病毒肺炎（以下简称“新冠肺炎”）诊断的金标准^[1]，但有临床医生发现，新冠肺炎影像学表现与核酸检测结果有不一致的病例，也出现了诸如“检测4次，才发现核酸阳性”“CT结果来做确诊，不要迷信核酸”等具有争议的报道。核酸检测具有早期、敏感、特异性高、易操作等优势，但对于核酸检测结果的准确性，需要从样本类型、质量、实验因素、试剂盒性能及患者感染周期等影响因素来综合分析^[2]，尤其针对难诊断病例应当更加严格地控制检测准确性。本研究拟通过对1例2019-nCoV感染患者不同时间点送检标本、不同试剂检测结果进行比较分析，评价不同试剂盒性能，发现和提出目前2019-nCoV核酸检测试剂盒需要改进之处，提高筛查准确性。
1 资料与方法
1.1 一般资料  收集本院1例发热门诊患者（男，51岁）在不同时间点（2020-01-27、2020-01-31、2020-02-01）采集的3次咽拭子标本。
1.2 方法1.2.1 试验试剂  选取6个不同企业生产的试剂盒，分为A~F共6组。A组：圣湘生物新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸快速检测试剂盒（PCR-荧光探针法，批号：2020001），提取试剂盒（批号：2020001）；B组：北京卡尤迪新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N基因免核酸提取RNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法，批号：T2001-27Y）；C组：硕世生物新型冠状病毒（2019）核酸检测试剂盒（双重荧光PCR法，批号：20200108）；D组：中元生物新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法，批号：H200104）；E组：中山达安2019新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N核酸检测试剂盒（批号：2020001），提取或纯化试剂盒（批号：2019003）；F组：北京卓成惠生新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N基因双重实时荧光PCR检测试剂盒（批号：20200123）。
1.2.2 检测方法  实验人员严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）^[3]、《国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）的通知》(国卫办科教函〔2020〕70号) ^[4]及《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）》^[5]相关文件进行实验操作和生物安全防护。
（1）RNA提取：使用圣湘生物 Nathch CS全自动核酸提取系统和中山达安Smart32核酸提取仪，严格按照试剂说明书进行提取。（2）核酸扩增：使用ABI7500PCR仪根据不同厂家试剂说明书设置反应程序后扩增检测并对检测结果进行阴性、阳性的判定。（3）质量控制：每批试验均带阴性和阳性对照，阴性和阳性对照检测结果在控，则该批次试验有效，反之，无效。
1.3 统计学处理  采用Excel2003及SPSS17.0统计软件，通过计算变异系数（CV）比较不同试剂的批内重复性。
2 结果2.1 各试剂的基本情况  各试剂的基本情况比较见表1。6种试剂检测基因类型均为ORF1ab和N基因，A和D试剂含内标；A和B试剂可采用一步裂解法提取核酸，其余试剂均可采用磁珠法或柱提法（本研究未采用）提取核酸；C和E试剂最低检测限为1 000 copies/mL，F试剂说明书未提及，其余均为500 copies/mL；6种试剂RNA上样量、荧光检测和扩增循环数及结果判断稍有差异。本研究采用的标本类型为咽拭子，6种试剂均适用。本研究仅针对相应批号试剂。表1 各试剂的基本情况比较

-：未提及。

2.2 不同试剂的检测结果分析  对该患者的3次采样样品分别采用不同试剂核酸检测，结果见表2。C和F试剂检测ORF1ab和N基因3次结果均为阳性，但结果曲线图C试剂优于F试剂，见图1；D试剂均未检出N基因，A、B、E试剂均有未检出ORF1ab情况存在。其中A试剂检出率66.6%（4/6），B试剂试剂检出率66.6%（4/6）、C试剂试剂检出率100.0%（6/6）、D试剂试剂检出率50.0%（3/6）、E试剂试剂检出率83.3%（5/6）、F试剂试剂检出率100.0%（6/6）。 表2 不同试剂的检测结果

A：C试剂；

B： F试剂

图1 不同试剂检测结果曲线图 2.3 不同试剂重复检测结果CT值  6种试剂（A~F）重复检测结果CT值见表3，批内检测结果的CV见表4。结果显示：C试剂的批内重复性最佳（CV最小），B试剂第3次检测ORF1ab批内变异系数（CV_批内）最大，其余试剂（A、D、E、F）批内重复性检测结果CT值差异不明显。
表3 不同试剂重复检测结果CT值分析

表4 不同试剂重复检测结果的CV（%）-：无数据。

2.4 各试剂动态检测结果平均CT值  该患者不同时间点取样各试剂检测检测结果平均CT值见表5，F试剂（N和ORF1ab）和E试剂（ORF1ab）3次检测结果的CT值越来越小，A试剂（ORF1ab）第3次结果小于前两次结果，其余试剂3次检测结果CT值无趋势性变化（图2）。
表5 各试剂不同时间检测结果平均CT值

-：无数据。

A：N基因；

B：ORF1ab基因；

图中未标出A、B、D试剂未检出情况。
图2 各剂不同时间检测结果图
3 讨论本研究比较了6种国产试剂对弱阳性新冠肺炎患者核酸在不同时期采样的检测结果，结果显示：C试剂和F试剂检测能力较好，对2019-nCoV（ORF1ab和N基因）均能检出；D试剂对2019-nCoV（N基因）缺乏检测能力；A、B、E试剂对2019-nCoV（ORF1ab）检测能力需进一步提高；C试剂批内重复检测结果最理想；F试剂（N和ORF1ab）、E试剂（ORF1ab）和A试剂（ORF1ab）3次检测结果的CT值有趋势性变化。
本研究结果表明，国产6种试剂对弱阳性样品的检测能力参差不齐，少数试剂对2019-nCoV（ORF1ab和N基因）均能检出，而部分试剂只能检测出其中一个。从试剂方面分析原因：（1）可能与试剂引物设计有关；（2）与各位点检测灵敏度相关。弱阳性样品往往对试剂盒的灵敏度有较高要求，如果最低检出限达不到样品的检测浓度，则会导致假阴性结果^[6]。而如何判断，则需要对试剂盒上的性能参数进行验证。
该患者为感染初期到确诊的患者。理论上，病毒载量应该越来越高，所对应检测结果的CT值应该越来越小^[7]，但本研究中仅3种试剂有趋势性变化，表明各试剂的准确性和重复性有待提高。且从平行检测结果看，各试剂批内重复性也不一致。因此，实验室在使用新试剂前，或在更换试剂批号时，应做相应的性能验证，以满足实验室的检测要求^[8]。
新冠肺炎疫情属于突发公共卫生事件，各试剂商在最短时间内完成了核酸检测试剂盒的研发和审批，对试剂盒质量和性能参数设置难免有瑕疵，各试剂商也在不停的更新和优化中。但作为实验室，操作人员应在生物安全防护下严格遵循标准操作流程，严格质量控制，避免由于操作原因引起假阴性和假阳性结果，正确认识和看待检测结果。
本研究仅仅对各试剂某一批号的检测能力做了简要比较分析，样本量有限，并不能代表各试剂的整体检测性能。由于本院阳性确诊的病例数较少，因此研究对象缺乏，如有条件，需扩大样本量，进一步对不同试剂的核酸提取质量等指标进行有效评价，以满足临床所需。
参考文献 略 来源：重庆医学 回复 新冠试剂 可获取论文PDF版本

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