研究发现NOTCH3基因敲除小鼠并不会出现血管平滑肌细胞基底膜GOM沉积［12］，临床上NOTCH3基因无义突变也不引起CADASIL［13］。因此，目前较为公认的观点是，CADASIL的NOTCH3基因突变会导致突变蛋白获得新功能、促进蛋白的异常沉积，从而导致血管平滑肌细胞的损害。血管平滑肌细胞的结构及功能异常主要包括以下几个方面。
（一）NOTCH信号通路改变
NOTCH3蛋白属于NOTCH单次跨膜受体家族，NOTCH家族蛋白通常由内质网合成，之后到达高尔基体进行糖基化和S1剪切，最后相对分子质量为210 000的N端胞外结构域和相对分子质量为97 000的末端部分以非共价形式连接表达于细胞膜表面，末端部分由跨膜结构域和胞内结构域组成。当配体结合于NOTCH蛋白的胞外结构域时，会在近细胞膜处发生S2剪切及S3剪切释放胞外结构域、含有核定位信号的胞内结构域及较短的跨膜结构域。之后，胞内结构域进入细胞核与转录因子重组信号结合蛋白-Jκ（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region）等结合形成转录激活复合体，促进靶基因的表达［14］。
细胞中的质粒转染研究发现在CADASIL的致病突变中，除了位于NOTCH3蛋白配受体结合区域的突变外，其他部位的突变不会影响下游靶基因的表达水平，NOTCH通路活性未受明显影响［15, 16］。蛋白质印迹和生物素标记法也证实NOTCH3基因突变不影响NOTCH3蛋白的总表达量及膜表达量［17］。在转基因小鼠中的研究还发现纯合敲除NOTCH3基因的小鼠并不会出现类似CADASIL的小动脉管壁蛋白沉积及早期脑白质病变［15］。上述研究结果表明，CADASIL中的NOTCH3基因突变对血管平滑肌细胞的影响并不是由于通路活性的缺失。近年来，在小鼠模型和患者来源的诱导多能干细胞中，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction）技术及转录组分析技术发现，CADASIL小鼠及细胞中NOTCH通路靶基因的表达水平上调，提示NOTCH通路活性上调，这一发现进一步说明通路活性的缺失不是CADASIL的致病机制，通路活性上调或有害功能的获得可能才是疾病的发病原因［18, 19］。
（二）蛋白的异常聚集及沉积
电镜下血管平滑肌细胞基底膜上的GOM结构是CADASIL中蛋白异常沉积的直接证据（图1），免疫电镜证实GOM中有NOTCH3蛋白胞外段的存在［20］。免疫组织化学和免疫荧光染色发现小动脉管壁还存在其他细胞外基质蛋白的沉积，包括玻连蛋白、组织金属蛋白酶抑制因子-3（tissue metalloproteinase inhibitor-3，TIMP-3）、潜在转化生长因子-β结合蛋白1（latent transforming growth factor beta binding protein 1）、二甘聚糖（biglycan）和核心蛋白（decorin）等［21, 22］。这些蛋白的异常沉积会影响小动脉的正常结构及功能，如二甘聚糖可能与患者小动脉管壁的纤维结缔组织增生相关［21］，TIMP-3的增加与小鼠模型中小动脉功能异常及脑血流下降有关［22］。
图1 皮肤小动脉血管平滑肌细胞表面的颗粒状嗜锇物质（箭头，本图为本科室病理实验室图片，为原创）
Figure 1 Granular osmiophilic material on the surface of vascular smooth muscle cells of cutaneous smallarteries (arrows, this picture is the original picture of pathology laboratory in our department)
蛋白异常聚集及沉积的原因未明，可能与突变NOTCH3蛋白胞外段存在未能正常配对的半胱氨酸残基有关。研究发现突变的NOTCH3蛋白可以自我聚集形成二聚体或多聚体，用β-巯基乙醇处理后，这些二聚体及多聚体消失，进一步证实了上述假说［23, 24］。此外，过表达实验发现突变NOTCH3蛋白在细胞中的清除时间延长［25］，免疫荧光染色标记NOTCH3蛋白和溶酶体后使用共聚焦显微镜成像发现患者的血管平滑肌细胞存在自噬体-溶酶体融合步骤的缺陷［26］，提示CADASIL中存在NOTCH3蛋白的清除障碍，不能被正常清除的NOTCH3蛋白将有可能在细胞内外发生聚集及沉积。蛋白的异常聚集及沉积可以进一步导致内质网氧化应激、细胞凋亡和细胞功能的异常［18］。
（三）离子通道的异常
管腔压力的改变可以引起血管平滑肌的收缩，管腔压力改变时血管平滑肌细胞膜会发生去极化，当去极化水平到达阈值时，细胞膜上的电压敏感钙通道打开，钙内流并引发细胞收缩。研究发现CADASIL模型小鼠的血管平滑肌细胞中电压门控钾通道（KV1）的表达量上调，导致细胞在生理性管腔内压力增加时去极化程度较对照组减小，进而影响血管的收缩功能，使用4-氨基吡啶（4-aminopyridine）及表皮生长因子受体激动剂肝素结合表皮生长因子（heparin binding epidermal growth factor， HB-EGF）促进KV1通道内吞作用、降低KV1电流密度后，血管的收缩功能可以得到一定程度的恢复［27］。另一项在小鼠模型中的研究提示，小动脉管壁中沉积的TIMP-3蛋白也可以通过上调血管平滑肌细胞膜钾通道的表达量来影响小动脉的收缩功能，而TIMP-3蛋白的沉积很可能由突变的NOTCH3蛋白介导，使用去整合素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17）和HB-EGF抑制TIMP-3的活性可以调节小动脉的功能［11］。血管平滑肌细胞膜离子通道的改变会直接影响小动脉的收缩功能，但目前这一方向的研究尚少，膜离子通道异常的机制也有待进一步研究。
（四）细胞骨架结构的改变
Ruchoux等［28］在小鼠模型中发现疾病早期血管平滑肌细胞会有细胞骨架及黏附连接结构异常，这会导致细胞从细胞外基质上解锚定，进而凋亡。之后在患者原代血管平滑肌细胞及诱导多能干细胞来源的血管平滑肌细胞中也都证实了细胞骨架结构及黏附连接结构的异常，表现为荧光显微镜下微丝及中间丝骨架的聚集增加、形态僵硬，黏附连接数目及大小的变化［19， 29, 30］。Dziewulska和Nycz［31］发现CADASIL患者脑小动脉管壁整合素蛋白的表达量降低，整合素蛋白常与黏附连接结构一起来调节细胞的黏附、凋亡、迁移等功能，其表达的异常会导致细胞的失巢凋亡。在血管平滑肌细胞中，细胞骨架结构有助于细胞感知管腔血流的变化，协助血管收缩和舒张。因此，CADASIL血管平滑肌细胞中异常的细胞骨架结构可能与疾病相关的血管反应性异常有关。最新的一项研究表明，CADASIL血管平滑肌细胞中存在NOTCH信号通路上调导致的Rho激酶通路蛋白（Rho associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK）活性升高［18］，ROCK与细胞骨架的动态调控有关，这可能是CADASIL血管平滑肌细胞出现细胞骨架结构异常的可能原因之一。
（五）增殖能力的改变
目前对CADASIL血管平滑肌细胞增殖能力改变的研究结论不十分一致。在皮肤组织小动脉来源的原代血管平滑肌细胞和诱导多能干细胞来源的血管平滑肌细胞中的研究发现患者细胞的增殖能力增强［18, 19］。患者脑组织病理发现，血管平滑肌细胞标志物从正常情况下以中膜表达为主的分布形式转变为内膜表达，提示患者的血管平滑肌细胞可能发生了表型转化，即由收缩型转变为合成型，合成、迁移及增殖能力增强［32］。病理研究还发现皮肤及骨骼肌小动脉的血管平滑肌细胞出现增殖标志物的上调表达，且细胞核的结构和数目出现异常，提示细胞有丝分裂不稳定、过早或不正确地进入细胞周期［33］。但另一些在脐带来源血管平滑肌细胞中的研究发现患者细胞增殖能力下降［34］。不一致的研究结果可能与细胞来源和检测手段的差异有关，患者血管平滑肌细胞增殖能力的改变有待进一步研究。
（六）其他信号通路的参与
对CADASIL患者脑组织的病理研究发现，突变的NOTCH3蛋白与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路的关键调控蛋白在血管壁发生共定位与沉积，提示TGF-β通路可能存在异常［35］。在CADASIL患者来源的血管平滑肌细胞中发现TGF-β的表达量增加，且血管平滑肌细胞分泌的TGF-β会影响血管内皮细胞的增殖［36］。此外，临床表现和影像学均与CADASIL极为相似的常染色体隐性遗传脑动脉病伴皮质下梗死及白质脑病（cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CARASIL）的致病机制即为TGF-β通路活性的异常增强，由其致病基因HTRA1编码的HTRA1蛋白是重要的TGF-β通路抑制因子，蛋白突变后丧失通路抑制功能使得TGF-β信号通路活性上调，细胞外基质蛋白的合成与累积增加，最终造成血管壁纤维化。CADASIL与CARASIL极为相似的临床与影像学表现也提示我们，TGF-β通路可能也参与CADASIL小动脉病变的发生发展。
在诱导多能干细胞来源的血管平滑肌细胞中的研究还发现，患者来源的细胞存在核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的激活，且NF-κB的激活可能由NOTCH通路活性的上调介导，但上述结果还需更多的实验证据支持［19］。由于炎性通路可以进行药物干预，对CADASIL小血管病变中炎性通路作用的进一步研究也将有利于治疗手段的研发。