妈妈，人是Cell生的（？）
大家好，我是雪梨~
（研究经费不够，没有大佬向我砸经费的情况下，可以考虑中性粒细胞结合生信）妈妈，我又省钱啦！
中性粒细胞是最丰富、最有效的病原体防御者，在各种癌症中发挥着对抗的作用。但是中性粒细胞的半衰期很短，使得研究中性粒细胞在癌症中如何采用特定手段，仍然是困难的问题。
本篇论文团队生成并整合来自17种癌症类型的单细胞中性粒细胞转录组，分析中性粒细胞10种不同的状态，包括炎症、血管生成和抗原呈递。研究数据表明了中性粒细胞在不同癌症中的差异，为抗原递呈中性粒细胞递送等治疗与研究策略提供了新的可能性。
另外，本篇64.5Cell更有一目了然的摘要图说明技术路线！
下面就一起来看看吧！
预计阅读时间：15分钟
文献背景
Neutrophil profiling illuminates anti-tumor antigenpresenting potency
中性粒细胞图谱揭示抗肿瘤抗原递呈效力
期刊：Cell
IF：64.5
文献背景
技术路线
话不多说先上图形摘要！你学会思路设计了吗？
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样本收集与处理：
从17种癌症类型的225个样本中收集了中性粒细胞，样本来自143名患者。
对中性粒细胞进行标准化处理，包括流式细胞术分选和单细胞转录组测序。
单细胞转录组测序：
对中性粒细胞进行单细胞转录组测序，使用10X Genomics的Chromium系统进行。
对测序数据进行质量控制、处理、注释和可视化。
细胞状态分析：
使用多种方法对中性粒细胞的10种细胞状态进行鉴定和特征分析。
通过单细胞RNA测序数据推断中性粒细胞的转录程序。
功能分析：
分析不同中性粒细胞亚群的功能特征，如代谢途径、HLA分子表达等。
探究精氨酸代谢如何影响中性粒细胞的HLA-DR+抗原呈递程序。
细胞间作用分析：
分析中性粒细胞与T细胞的细胞间作用和通信。
使用单细胞RNA测序数据推断中性粒细胞与T细胞的相互作用。
动物模型实验：
在小鼠模型中验证精氨酸饮食和抗PD-1治疗对肿瘤微环境中HLA-DR+中性粒细胞的影响。
探索中性粒细胞在抗肿瘤免疫治疗中的潜在价值。
人体样本验证：
在多个免疫治疗患者样本中验证HLA-DR+中性粒细胞与治疗反应的相关性。
验证抗PD-1治疗与中性粒细胞的协同效应。
综合分析：
综合分析单细胞RNA测序数据和空间转录组数据，以全面了解中性粒细胞在肿瘤微环境中的作用。
构建了一个关于中性粒细胞在多种癌症中的单细胞转录组数据集，为后续研究提供了重要资源。
研究结果
Figure1
Figure1 泛癌单中性粒细胞图谱的生成
A. 泛癌样本的中性粒细胞共识浸润水平（TCGA），从左到右依次为中性粒细胞浸润水平、癌症类型和排名共识得分。发现中性粒细胞在不同癌症类型中的浸润水平存在显著差异，并且可以分为高、中、低三个浸润亚型。
B. 根据免疫亚型划分的中性粒细胞共识浸润水平（TCGA），揭示中性粒细胞倾向于浸润炎症性或纤维化抑制性TME。
C. 展示新产生的数据和公开数据的样本量和细胞数量。
D. 展示单细胞转录组分析得到的10种中性粒细胞亚群，以及每种亚群的特征基因表达热图和富集的生物途径。这些亚群包括炎症反应、血管生成、抗原呈递等特征的亚群。
E. 中性粒细胞亚群的基因表达热图（前50个），表达了不同的特征基因。
F. 各中性粒细胞亚群的富集通路（KEGG和Hallmark数据库），每种亚群特征基因参与不同的生物途径，可能驱动了亚群间的功能差异。
Figure2
Figure2 中性粒细胞的分子特征和生存相关性
A. 使用TooManyCells根据细胞亚群（左）和癌症类型（右）划分的中性粒细胞树状结构。可看出中性粒细胞亚群之间的发育关系，以及它们在不同癌症类型中的差异分布。
B. 不同癌症类型中的中性粒细胞 Ro/e（观察到的细胞数与预期细胞数之比）。Ro/e值大于2的亚群表示该亚群在相应癌症类型中高表达，显示HLA-DR+CD74+和VEGFA+SPP1+亚群在多数癌症类型中具有高表达。
C. 展示了流式细胞术和单细胞转录组测序预测的HLA-DR+和SPP1+亚群在相应癌症类型中的浸润比例，两者之间存在显著相关性。
D. 展示了HLA-DR+和SPP1+亚群在独立多癌症组织微阵列(TMA)数据集中的浸润比例，与单细胞转录组测序预测的结果一致。
E. 基于 scRNA-seq 和 mIHC 的 HLA-DR+ （左）或 SPP1+ 中性粒细胞（右）浸润之间的相关性。y 轴代表 mIHC 估算的比例。x 轴代表 scRNA-seq 估算的中性粒细胞亚群Ro/e。
F. 中性粒细胞特征的预后价值（TCGA 数据集），显示了中性粒细胞亚群特征的危险比值（左）和对数值（p 值）（右）。x 轴的左右两侧均代表正值，因为所有对数值（p 值）均大于零。
G. 使用 mIHC 对 8 个癌症-TMA 队列中的 HLA-DR+ CD15+ 中性粒细胞进行生存分析，HLA-DR+CD74+亚群与免疫治疗响应患者生存期的显著正相关性。
H-J. 不同表达的细胞因子（H）、MHC 分子（I）、免疫表型和特征（J）的表达谱。HLA-DR+CD74+亚群在免疫治疗响应患者中显著富集，而在无响应患者中显著减少。
Figure3
Figure3 HLA-DR+中性粒细胞终末分化和代谢重编程
A. 通过 scTour、CytoTRACE、monocle3 和 Slingshot（STAR 方法）估测的分化状态。
B. 按癌症专科（Ro/e）和分化状态（通过 scTour 估计的假时间）排列的中性粒细胞亚群（上图）以及癌症专科（Ro/e）和假时间之间的相关性（下图）。
C. 流式细胞术检测从 8 种癌症类型的 24 个肿瘤样本中分离出的 HLA-DR+ 和 HLA-DR- 中性粒细胞中 CD11b 和 CD16 平均荧光强度 (MFI)。
D. 多癌TMA队列中使用mIHC检测的SPP1+CD15+、HLA-DRCD15+和HLA-DR+CD15+中性粒细胞中CD11b高和MPO高的中性粒细胞比例。
E. 多癌-TMA 队列中使用 mIHC 检测的 HLA-DR+ 和 HLA-DR- 中性粒细胞的 CD11b 和 MPO 强度。
F. 由 scMetabolism 测定的中性粒细胞亚群的氨基酸代谢途径活性。
Figure4
Figure4 亮氨酸通过代谢-表观遗传调控促进HLA-DR+中性粒细胞生成
A. 体外筛选20种氨基酸以研究它们与中性粒细胞免疫表型的相关性。
B. 每种氨基酸刺激下的 HLA-DR+ 中性粒细胞比例（对照组，仅 LPS）。右图显示在亮氨酸和对照条件下 HLA-DR 水平的中性粒细胞。
C. 亮氨酸组和对照组中性粒细胞上 CD80、CD86 和 CCR7 表达的比较。
D-F. 依次为MHC-II复合物组装基因、抗原处理蛋白酶基因、MHC-II抗原负载基因的相对RNA表达。
G. 亮氨酸处理组和对照组中 RNA-seq 的 MHC II 类特征。
H. 亮氨酸处理的中性粒细胞与对照组的代谢物比较。
I. 使用流式细胞术检测亮氨酸处理的中性粒细胞和对照组的线粒体聚集水平。
J. 亮氨酸处理的中性粒细胞与对照组的实时耗氧率（OCR）。
K. 亮氨酸组和对照组线粒体透射电镜成像。
L. 基于 HLA-DR+ 中性粒细胞 scRNA-seq 数据的线粒体呼吸复合体特征。
M. 抑制线粒体呼吸复合体 I 可降低 HLA-DR+ 的比例。
N. 13C 标记的亮氨酸显示其分解为乙酰-CoA、TCA 循环和谷氨酰胺。
O. 亮氨酸乙酰-CoA 依赖性调节 HLA-DR+ 中性粒细胞。AcCoAa，AcCoA 激活剂；AcCoAi，AcCoA 抑制剂。
P. 对照组、亮氨酸处理组和 AcCoAa（AcCoA 激活剂）组之间组蛋白 H3K27ac 的水平。
Q. 使用 CUT&Tag 对亮氨酸组和对照组的 H3K27ac 峰进行热图分析。重复数据合并可视化。
R-S. MHC-II基因转录起始位点（TSS）上的H3K27ac、H3K27me3和H3K4me3覆盖率（R）和得分比较（S）。MHC-II 基因列表来自 GO 基因组数据库。为可视化目的，对复制进行了合并。
T. 亮氨酸组和对照组 HLA-DRA 和 HLA-DQB1 基因座上的 H3K27ac 修饰。
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Figure5
Figure5 HLA-DR+ 中性粒细胞和相关T细胞反应
A. 免疫细胞类型（通过匹配的RNA测序估计）与中性粒细胞亚群之间的相关性。
B. RCC、OV 和 CRC 样本中 HLA-DR+ 中性粒细胞特征与 CD8+ T 细胞之间的空间共定位。
C. 肿瘤浸润的HLA-DR+ 中性粒细胞或无HLA-DR+中性粒细胞共培养的 T 细胞 TNFa 强度（以 CD3+ T细胞为靶标）。条形图为平均值±标准偏差。中性粒细胞和自体T细胞分别从肿瘤（HCC和COAD）和匹配的血液样本中分拣。
D. 基于 scRNA-seq 数据的肿瘤浸润中性粒细胞 MHC-II 等位基因定量。
E. 与亮氨酸处理过的中性粒细胞（HLA-DR+ 中性粒细胞）、未处理过的中性粒细胞（HLA-DR- 中性粒细胞）共培养时的 T 细胞反应性（4-1BB 强度）或阴性对照。加入了MHC-II 肽（gp100，44-59；CMV，65-71）。
F. 与喂有新抗原的 HLA-DR+ 中性粒细胞共培养时的 T 细胞细胞毒性（TNFa 强度）。自体亮氨酸诱导的 HLA-DR+ 中性粒细胞、自体白细胞诱导的 HLA-DR+ 中性粒细胞、自体 DCs和T细胞都是从健康献血者的血液中分拣出来的。
G. 在不同的NEU:T比例和肽浓度下，与喂有KRASG12V（MTEYKLVVGAVGVGKSALTIQLI）或KRASG12D（LVVGADGV）新抗原的HLA-DR+中性粒细胞共培养时的T细胞反应性。
H-I. HLA-DR+中性粒细胞或DC喂食KRASG12V新抗原刺激的T细胞的TCR重排（H）和TCR克隆型比例（I）。同时加入CD3/CD28 dynabeads（与T细胞的比例为4:1），共培养7天。
J. 在涵盖 8 种癌症类型的多癌-TMA 队列中使用 mIHC 分析 HLA-DR+ 中性粒细胞（HLA-DR+CD15+）与反应性 CD4 T 细胞（CXCL13+CD39+CD4+）之间的关联。右图表示 HLA-DR+ 中性粒细胞高/低样本中 CD39+ CXCL13+ CD4+ T 细胞的数量。
Figure6
Figure6 抗原递呈中性粒细胞与相关体内免疫表型之间的相关性
A. 根据小鼠肿瘤浸润中性粒细胞的标记基因和癌症类型，将小鼠肿瘤浸润中性粒细胞的 UMAP 与人类中性粒细胞亚群进行比较。
B. 小鼠中性粒细胞的抗原递呈基因表达和特征。
C. Cd74+中性粒细胞（LLC、MC38 和 Hepa 1-6）的代表性 mIHC 图像。
D. LAT1KO、Bcat2KO、DbtKO 和野生型小鼠血液中经亮氨酸处理和对照组中性粒细胞的 Cd74+ 中性粒细胞比例。
E. MHC-IIflox/flox; Ly6GCre-tdTomato 小鼠与野生型小鼠肿瘤体积的比较。
F. MHC-IIflox/flox; Ly6GCre-tdTomato 小鼠和野生型小鼠在 LLC、MC38 和 Hepa 1-6 皮下模型中肿瘤内 Cd8a+T 和 Cd4+T 细胞的比例。第 16 天（MC38 和 Hepa 1-6）和第 18 天（LLC）采集样本。
G. 在LLC、MC38和Hepa 1-6皮下模型中，亮氨酸饮食诱导肿瘤内中性粒细胞Cd74+比例升高。样本于第十二天采集。
H. LLC、MC38 和 Hepa 1-6 皮下模型中，亮氨酸饮食组和对照组的瘤内 Cd8a+T 和 Cd4+T 细胞比例。第十二天采集。
I. 在 LLC、MC38 和 Hepa 1-6 组中，亮氨酸饮食组与对照组之间 Cd4 和 Cd8a 阳性细胞的代表性 mIHC 图像。
Figure7
Figure7 抗原递呈中性粒细胞的治疗价值研究
A. 亮氨酸饮食加 aPD-1 处理组、亮氨酸饮食加异型处理组、单独 aPD-1 处理组和对照组的肿瘤体积。
B. 与7A相同的对照组，展示Cd74+ 中性粒细胞收养递送组、Cd74-KO 中性粒细胞收养递送组和对照组的肿瘤体积。
C. Cd74+ 中性粒细胞收养递送加 aPD-1 治疗组、Cd74-KO 中性粒细胞收养递送加 aPD-1 治疗组和单独 aPD-1 治疗组的肿瘤体积。单用 aPD-1 组与图 7A 相同。收养转移 Cd74+NEU 组与图 7B 相同。图 7A-7C 中的数据在同一批次中进行。
D-E. HLA-DR+CD74+中性粒细胞特征与免疫治疗患者生存期（D）和应答模式（E）的关系。
F-G. 自体HLA-DR+中性粒细胞和患者血液中不同细胞数的HLA-DR中性粒细胞（F）以及患者血液中HLA-DR+中性粒细胞、PD-1抗体或它们的组合（G）刺激的PDTF模型中CD4+细胞（上图）和CD8+细胞（下图）中4-1BB+、CD39+、GZMB+、IFNg+和TNFa+亚群的比例。
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总结
这项研究主要关注了中性粒细胞在癌症中的作用，特别是在免疫治疗中的潜在价值。通过单细胞转录组测序技术，研究人员分析了来自17种癌症类型的225个样本中的中性粒细胞，发现了10种不同的细胞状态。其中，HLA-DR+CD74+亚群在多种癌症类型中广泛存在，并且与较好的预后相关，表明该亚群具有潜在的抗肿瘤抗原呈递的能力。
研究还发现，通过精氨酸代谢可以激活中性粒细胞的HLA-DR+抗原呈递程序，其机制涉及线粒体代谢、乙酰辅酶A产生以及组蛋白H3K27ac修饰的调控。在小鼠模型中，抗PD-1治疗和精氨酸饮食可以增强肿瘤微环境中的HLA-DR+中性粒细胞比例，并促进T细胞的浸润和激活。在人体样本中，HLA-DR+中性粒细胞与抗PD-1治疗的生存相关，并在免疫治疗中显示出协同作用。
总的来说，这项研究不仅揭示了癌症中性粒细胞的异质性，还提出了基于中性粒细胞的抗肿瘤免疫治疗新策略，为临床应用提供了潜在的可能性。
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