孟德尔随机化研究发高分有多难？
大家好，我是雪梨~
主动脉瘤（aortic aneurysm，AA）以主动脉病理性扩张为特征，是心血管疾病发病率和死亡率的重要危险因素。其发病机制复杂多样，且炎症在AA中的关键作用日益突出，但目前仍缺乏有效临床转化的关键细胞因子或靶点。
本篇文献于三周前见刊，研究团队来自华中科技大学，他们做出了迄今为止纳入变量最多的关于炎症和AA的MR研究。并且，结合了转录组和单细胞的分析手段。对于MR套路日益盛行，发文更具挑战性的当下，不可谓不是一种升华文章质量的思路。并且，文章采用的图表呈现较为多样，美观而不失清晰，是很好的参考。
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文献背景
Deciphering the role of CX3CL1-CX3CR1 in aortic aneurysm pathogenesis: insights from Mendelian randomization and transcriptomic analyses
解密 CX3CL1-CX3CR1 在主动脉瘤发病机制中的作用：孟德尔随机化和转录组分析的启示
期刊：Frontiers in Immunology
IF：7.3
文献背景
技术路线
孟德尔随机化分析确定了循环炎性细胞因子与AA之间的互为因果关系，免疫细胞特征与AA之间的因果关系
MR研究的三个假设：
遗传变异作为一种工具变量与暴露有关；
遗传变异与混杂因素无关；
遗传变异仅通过暴露而非其他途径影响结果。
孟德尔随机化分析：利用GWAS数据，对91个循环炎症因子和731个免疫细胞表型与动脉瘤的关系进行了孟德尔随机化分析，以识别与动脉瘤相关的候选因子。具体的方法包括反方差加权法（IVW），MR Egger 回归法、加权中值法和简单中值法。具体的敏感性分析方法包括异质性检验、多效性检验和撇除敏感性检验。
转录组分析：利用bulk RNA测序数据，分析了动脉瘤组织和对照组织中CX3CR1的表达水平，发现其在动脉瘤组织中显著上调，并与其配体CX3CL1的表达无显著变化，暗示其可能参与动脉瘤的免疫调控。
单细胞测序分析：利用已发表的单细胞测序数据，分析了动脉瘤组织和正常组织中各细胞类型的表达谱，确认了CX3CL1主要在内皮细胞中表达，而CX3CR1主要在单核细胞中表达。
功能分析：对GO和KEGG进行了通路分析。利用轨迹分析、CytoSig数据库等，分析了CX3CL1对CD14+CD16+单核细胞的下游效应，发现其可促进单核细胞的促炎激活。
人类样本验证：通过免疫荧光染色，验证了CX3CL1和CX3CR1在动脉瘤组织中的表达和定位。
（研究过程中遵循了《赫尔辛基宣言》的指导原则。）
研究结果
Figure2
Figure2 炎症细胞因子与AA的因果关系
(A) 循环热图显示了四种方法（IVW、MR Egger、简单中值和加权中值）中每种方法下 91 种细胞因子的 p 值。初步候选者（IVW p<0.05）用红色标出。
筛选出成纤维细胞生长因子5（FGF5）、干细胞因子（SCF/c-kit）、碎裂素Fractalkine/CX3CL1和白细胞介素-20受体亚基α（IL20RA）
(B) 森林图分别显示 FGF5、SCF、CX3CL1 和 IL20RA 作为暴露因子的 ORs 和 95%置信区间。
可以看出FGF5、CX3CL1和IL20RA与AA风险增加相关，SCF与AA风险降低相关。
Figure3
Figure3 森林图和散点图显示了 4 个候选因子与 AA 之间的关联
(A) 森林图显示了 FGF5 与 AA 之间的正相关性。
(B) 散点图显示了四种 MR 方法中 24 个 IV 对 AA 的因果效应。
(C）显示 Fractalkine 与 AA 正相关的森林图。
(D) 显示 23 种 IV 对 AA 的因果效应的散点图。
(E，F） IL-20RA 与 AA 的正相关性。
(G，H）SCF 与 AA 的负相关性。
Figure4
Figure4 AA 对循环炎症细胞因子的因果效应
为了进一步澄清正向分析所确认的因果关系，我们利用 AA 作为暴露因子进行了反向MR分析。
(A) 循环热图显示，当 AA 被设定为暴露因子时，四种方法中每种方法对 91 种细胞因子的 p 值。被选中者（与 IVW 相比 p<0.05）用红色标出。
被选出的三个炎症因子与正向MR分析中确定的四个因子并不重叠。
(B) 森林图分别显示单核细胞趋化蛋白-4（CCL4）、神经胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF）、 和 肿瘤坏死因子（TNF）作为结果的估计 OR 和 95%置信区间。
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Figure5
Figure5 配对配体-受体的表达谱显示 CX3CR1 的免疫调节作用
(A) CX3CL1、CX3CR1、KIT 和 KITLG 的归一化计数热图。CX3CR1和KIT的相应配体CX3CL1、KITLG没有明显变化。
(B, C) AA 组和对照组中 CX3CR1 和 KIT 的归一化计数。
在 AA 中，CX3CR1 的归一化计数明显上调，相反，编码 c-kit 的 KIT 在 AA 中明显下调。
(D) AA 组与对照组差异表达基因DEGs 的火山图（p<0.05，log2FC>0.95）。前十个最重要的DEGs 被标注出来。
发现CX3CR1是AA中上调最显著的DEG之一。
(E) 上调 DEGs 的基因本体富集分析。
"免疫反应"、"炎症反应"、"免疫反应的正向调节 "和 "抗原处理和通过 MHC II 类呈现外源多肽抗原 "在前 10 个富集词之中。
(F) AA 组和对照组 20 个免疫特征的免疫浸润图谱，发现在AA样本中，M1巨噬细胞和单核细胞的浸润明显增加。
(G）CX3CR1表达与免疫特征的相关性热图，CX3CR1 的表达与 M1 巨噬细胞和 CD4+ T 细胞呈正相关。
Figure6
Figure6 免疫细胞特征与 AA 的因果关系
受CX3CR1在调节AA免疫反应中的推测作用（尤其是M1巨噬细胞浸润显著上调）的启发，研究团队进一步从基因水平探讨了免疫表型与AA之间的因果关系。
以IVW为主要标准，以p<0.05为临界值，得到13种免疫表型与AA负相关，14种免疫表型与AA正相关。
Figure7
Figure7 单细胞表达谱确定了 EC 与单核细胞之间的 CX3C 信号传导
为了进一步确定上述配体-受体关系（CX3CL1-CX3CR1）的细胞类型定位，研究团队重新分析了之前发表的来自 3 个对照组和 8 个 AA 样本的 scRNA-seq 数据。
(A) UMAP 图显示了用不同颜色区分的 12 个群集。
(B) 与不同簇相关的相应标记基因的特征图。
(C) 所有 12 个集群中选定基因的平均表达量。
(D) 11 个样本在 12 种细胞类型中的百分比。
(E) 显示 CX3CL1 和 CX3CR1 的位置和表达水平的特征图。
(F) 12 个聚类中 CX3CL1 和 CX3CR1 的表达情况。
(G) CellChat 分析显示 12 个集群中 CX3C 信号通路的和弦图。
(H)显示交流概率的热图。
CX3CL1 主要由 ECs 表达，而 CX3CR1 则主要由单核细胞表达（图 7E、F），从内皮细胞（EC）到单核细胞的强烈信号，表明EC是CX3CL1的主要来源，CX3CL1与单核细胞上的CX3CR1结合产生下游效应。
Figure8
Figure8 CX3CL1 促进了中间单核细胞的促炎激活
(A) 9个髓系细胞群的UMAP图，以颜色区分。
(B) 相关标记基因的特征图。
(C) FCGR3A (CD16)、CD14 和 CX3CR1 的特征图。右下方的特征图显示了三者的共定位。
(D) 正常和升主动脉瘤标本的多重免疫荧光染色图像。左图中，箭头表示 CX3CL1 和 CD31 的共定位；右图中，星号表示 CD16 和 CX3CR1 的共定位，箭头表示 CD16、CD14 和 CX3CR1 的共定位。
(E）正常样本和 AA 样本中 CX3CR1 和 CX3CL1 的相对平均荧光强度。
AA样本中CX3CR1的表达明显高于正常样本。
(F) CD16+ 单核细胞的轨迹分析显示了 3 个潜在的分化系。
(G) CX3CL1治疗组与对照组前100个DEGs的基因本体富集分析。
经 CX3CL1 处理的前 100 个上调基因富集在 "G 蛋白偶联受体信号通路"、"适应性免疫反应"、"白细胞介素-8 生成的正向调控 "和 "细胞粘附的正向调控 "中（图 8G），这些基因都表明细胞转向促炎状态，从而导致 AA 发病机制中的炎症级联反应。
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总结
整个研究采用孟德尔随机化方法探讨了循环炎性细胞因子与主动脉瘤（aortic aneurysm，AA）的因果关系。
在以往的研究中，MR已被用于证实低密度脂蛋白升高、高密度脂蛋白降低和AA的因果关系、阐明AA的药物靶点。该文献的研究则是迄今为止纳入变量最多的关于炎症和AA的MR研究。该研究使用的GWAS总结数据来自一项包含欧洲和东亚祖先的跨人群荟萃分析，进一步增强了结论的普适性。然而，纳入AA表型过于宽泛，也会导致不利于今后做出精确的医疗决策。
早在 2008 年，就有人提出 CX3CL1 可能通过招募炎症细胞加速 AA 的进展。该文献的研究首次利用基因工具解决了 CX3CL1 与 AA 之间的单向因果关系，进一步提示了 CX3CL1 作为 AA 预测因子的巨大潜力。暴露于紊乱血流中的心肌细胞会上调 CX3CL1，针对它的中和抗体能显著减轻ldlr基因敲除小鼠的主动脉病变面积，这表明它有可能成为干预靶点。
总之，本研究验证了 CX3CL1-CX3CR1 在 AA 中的致病作用，靶向抑制可能会缓解 AA 的进展。
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