3+2经典汇总 | 全长转录组方案设计策略
快速出文章，数据丰富不划水，全长转录组测序可以满足您的需求！今日我们总结了比较经典的全长转录组方案，下文以其中某个比较经典的为例（3代全长转录组+2代转录组测序），篇幅有限，更多方案详情及经典案例可以在下方给小编留言哦~~^_^
一，简介
全长转录组测序：利用三代测序平台对某一物种的mRNA进行测序研究，因其可直接获得从5’端到3’端的高质量转录组信息而称为全长转录组测序。全长转录组测序无需组装，直接获得单分子全长mRNA信息，同时可准确鉴定基因的可变剪接、APA、融合基因、基因家族和非编码RNA等信息。
二、二代和三代比较
三代测序由于其读长较长，对于转录本的结构相关分析具有优势，但是因为其成本较高，数据量并不能达到计算转录本表达量的目的，因此关于样本中表达量的差异比较还是需要借助二代测序。
而二代测序读长较短，许多和结构相关的测序解果并不准确或者不能分析，例如可变剪接、APA、融合基因、基因家族这类的分析，则需要三代测序结果来辅助研究。
三、研究应用方向
1. 基因结构的研究：可变剪接、APA[1]、融合基因、基因家族、lncRNA及其靶基因预测。
2. 完善基因组注释：对于做基因组组装研究的，可以做三代转录组测序辅助基因组注释，对于基因组注释结果不好的，同样也可以利用三代结果来完善注释。
3. 基因功能研究：要获得整个转录本全长，获得CDS区域以及这个转录本所能够编码的蛋白，则需要做RACE实验的，而RACE成功率低且价格贵，这时候可以通过三代测序获得全长，无需RACE实验。
4. 与蛋白组联合分析：构建完善的蛋白搜索库；可变剪接事件的相互验证。
四、经典方案设计策略
1. 三代全长（单个样本）+2代测序（单个样本）
以某个种类的动物或者植物，不同发育阶段的组织或者相同发育阶段的不同组织进行混样测序（混样建议不超过6个，混样太多需要加大数据量），混合好的样本分别进行三代全长测序、二代转录组测序，以二代数据对三代数据的结果进行矫正，以三代数据结果为重点分析讨论基因结构相关研究[2~3]。
2.三代全长+2代测序（多个二代测序样本）
和上一个经典方案比较，这个方案有了不同组织的表达量的分析，并且因为有三代的数据，可以更加准确的对不同isoforms进行分析，区别在于，如果仅仅是做了二代转录组测序，那么只能对基因表达量分析。通过这样的isoforms差异表达量分析结果，结合我们的功能注释分析，就可以找到和研究相关的一些基因了。更加丰富了文章的数据结果，对于转录本表达量的分析也更加准确[4~6]。
3. 三代全长（多个样本）+2代测序（多个样本）
这里的路线图大部分和第2个方案相同，不同的是，用多样本做三代全长，可以分析到不同样本中可变剪接的变化[7]；或者通过通过Iso-seq技术手段研究少数近缘物种间的亲缘关系以及不同物种或亚种间的mRNA序列差异，挖掘明显受到正向选择或负向选择的基因[8]。
4. 三代全长+二代测序+蛋白/代谢/甲基化
第4种方案呢，则是加上了其他组学，例如：分析DNA层面的甲基化修饰，可以分析表观修饰对AS的影响，也可利用三代的结果结合二代，准确分析关键转录本的表达量的变化情况[9]；从转录本到蛋白的角度去联合分析，可以用转录组的结果构建蛋白库，如果是做了多个样本的三代全长，则还可以分析不同可变剪接形式所产生的蛋白丰度变化等等[10]；而代谢是最接近表型的结果，转录组和代谢的联合分析思路当然也可以应用在这里。
5. 三代全长+全转录组测序
（或者挑其中的miRNA、lncRNA来做）
mRNA和非编码的联合分析我们已经熟知，当然如果再结合三代来做则数据更加丰富，且有三代作为结构上的参考定量结果更为准确，因此这样的联合分析思路也是一个不错的方案[9]。
五、数据量推荐和送样标准
单个组织测高丰度转录本：8G；
混合样本建议不超过6个：15G~20G；
样品类型：总RNA、组织样；
样品浓度：总RNA浓度≥ 50 ng/ul；
样品体积：> 10 ul；
样品总量：总RNA用量> 10 ug ；
样品纯度：OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.0，260nm处有正常峰值；
RNA完整性：总RNA的RIN值≥8.0，28S/18S≥1.5；图谱基线无上抬；5S峰正常。
延伸阅读
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【参考文献】
[1] Abdel-Ghany S E, Michael H, Jacobi J L, et al. A survey of the sorghum transcriptome using single-molecule long reads:[J]. Nature Communications, 2016, 7:11706.
[2] Chen S Y, Deng F, Jia X, et al. A transcriptome atlas of rabbit revealed by PacBio single-molecule long-read sequencing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1):7648.
[3] Dong J, Wang Y, Liu Y, et al. SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila (Selman and Vogt)[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1):2197.
[4] Wang B, Elizabeth T, Michael R, et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing:[J]. Nature Communications, 2016, 7:11708.
[5] Dong L, Liu H, Zhang J, et al. Single-molecule real-time transcript sequencing facilitates common wheat genome annotation and grain transcriptome research[J]. Bmc Genomics, 2015, 16(1):1-13.
[6] Xu Z, Peters R J, Weirather J, et al. Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis[J]. Plant Journal, 2015, 82(6):951-961.
[7] Kuang Z, Boeke JD, Canzar S. The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms[J]. Genome Research, 2017, 27(1):145-156.
[8] Ding N, Wang A, Zhang X, et al. Identification and analysis of glutathione S-transferase gene family in sweet potato reveal divergent GST -mediated networks in aboveground and underground tissues in response to abiotic stresses[J]. Bmc Plant Biology, 2017, 17(1):225.
[9] Wang M, Wang P, Liang F, et al. A global survey of alternative splicing in allopolyploid cotton: landscape, complexity and regulation.[J]. New Phytologist, 2018, 217(1):163.
[10] Zhu F, Chen M, Ye N, et al. Proteogenomic analysis reveals alternative splicing and translation as part of the abscisic acid response in Arabidopsis seedlings[J]. Plant Journal, 2017, 91(3):518-533.