技术比较| Nanopore全长转录组 VS二代转录组
2020年即将过半，是时候来盘点一下Nanopore全长转录组（后简称ONT全长转录组）和二代转录组了。有没有必要做全长转录组？全长转录组数据好在哪里？希望这篇分享，能够帮您解答一二。
自从测序成本不断降低，分析流程不断完善，分析内容不断深入，转录组测序基本已经成为各个课题不可或缺的部分。无论是在项目前期筛选目标通路和基因，还是在后期做基因功能验证，调控网络挖掘，亦或是通过SNP/INDEL，SSR等针对物种、品种、突变体的深入研究，转录组的应用大部分还停留在基因表达量这个层面上。正是因为研究目标物和切入点的单一性，近些年通过转录组发表文章更加难了。我们不乏看到各种软文分享，“一文教你转录组数据如何挖掘”，“转录组文章怎么展示结果”，“转录组文章思路和常用软件”，这些也仍然是基于基因的表达量来做深入的数据解读。根据NCBI的数据显示，从2015年开始，转录组文章的发表数量有逐年回落的趋势，也正是从2015年开始，国内外发表的文章中使用ONT全长转录组技术的越来越多。那么这些“异军”如何凭借新技术突出重围的呢？我们先来看看二代和三代技术的区别。
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测序技术
ONT全长转录组测序基于牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代测序平台，当碱基通过纳米孔时，会产生不同的阻碍作用，纳米孔两端施加有电压，因此会产生不同的电信号变化，通过识别不同的电信号来判读碱基信息。相较于二代转录组，ONT全长转录组实验过程中，无需打断，直接获取转录本的5ˊ到3ˊ高质量全长序列，而且做到实时测序。Illumina平台一般读长为双端150bp，而ONT平台最长读长可达到2.3Mb。不打断建库和超长读长这两点保证了一次性读出mRNA整条序列，得到真正意义上的全长信息。有文章[1]显示，ONT全长转录组直接测到一个12.7 kb的复杂转录本，由63个外显子组成，通过比对发现测得的转录本完全匹配现有数据库的注释结果AT1G48090.4 isoform。
ONT检测到拟南芥复杂转录本
基于全长的信息，ONT全长转录组有独特的优势，尤其是在转录本定性和定量方面，在可变剪接鉴定方面也有了极大的提升。与此同时，很多老师担心ONT全长转录组的碱基准确性和错误类型，具体信息可以见表1。
表1 技术比较
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转录本鉴定
ONT全长转录组的碱基质量，读长情况，比对率，转录本鉴定到底如何，我们根据真实项目的数据来看看。各个物种测序数据量从2G到10G不等，N50都在1.1Kb-1.5Kb，属于正常范围，质量值平均达到Q10，全长率基本在80%左右，与参考基因组的比对率基本都在90%以上（表2）。在转录本鉴定方面，ONT全长转录组可以鉴定到大量已知基因的新转录本。同一个拟南芥样品，二代转录组比对率是90.35%，而ONT全长转录组达到了97.74%，鉴定到的转录本总数量提升了46.6%，其中新转录本数量从179提升到了22807。（表3）
表2 ONT全长转录组特征值统计
表3 转录本数量比较ONT vs Illumina
2020年1月发表文章[1]，作者使用ONT技术直接对RNA进行测序，并展示了FLM基因的转录本异构体情况。如下图，黑色箭头表示互斥的外显子；蓝色是AtRTD2数据库和ONT共同识别的异型；绿色ONT识别的新异型。通过ONT技术揭示了一些迄今在拟南芥转录组中未发现的复杂剪接异构体。
ONT技术揭示可变剪接的复杂性
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多比对
基因组上许有多位点序列信息相似或者同源，当reads很短时，会出现reads多比对的情况，导致在后期做基因定量时会有一定的偏差。比如，基因A和基因B存在高度相似的保守区域（蓝色方块），当进行二代测序时会有完全属于该保守区域的reads出现，这些reads在比对时可以同时比对到2个基因组区域，而三代测序由于直接测到2个基因的全长转录本，因此不会出现多比对的情况。
根据拟南芥的实测项目，我们发现二代转录组确实会出现2个以上位点比对的情况，最多可达到8个位点；而ONT全长转录组只有极少的reads出现多比对情况，而且最多只有5个位点，比对位点越多，reads数量越少。由于二代和三代的多比对reads数不在一个数量级，对reads数进行log10变换后合并展示，ONT全长转录组的多比对明显降低。由此可见，通过ONT全长转录组对转录本进行定量更加准确，获得的转录本序列信息更加真实。
多比对示意图
（来源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮书）
拟南芥实测多比对reads分布图
（横坐标为多比对次数，纵坐标为对应的reads数）
多比对分布合并展示图
（横坐标为多比对次数，纵坐标为log10(reads数）
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饱和度
大家习惯了转录组6G或者Pacbio系列几十G的数据量，ONT全长转录组如何选择数据量呢？各个物种的基因组大小从Mb到Gb不等，然而，其转录组大小都是在Mb水平。因此转录组数据量的选择不会特别受物种影响。当选择2G数据量时，对于二倍体来说，除极低丰度表达基因未达到饱和外，其他表达水平的基因均可以测得饱和，这与二代的6G数据饱和度相似。故而2G ONT数据能达到6G Illumina检测效果。而对于多倍体生物，尤其是异源多倍体生物，若想让数据达到饱和，则需要加大数据量才能满足后续分析要求，实测数据饱和评估图如下。
定量相关性图
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GC偏好性
二代转录组由于测序片段短，且存在桥式扩增，会有GC含量和PCR碱基偏好性，在定量上并不能真实的反映转录本/基因的表达情况。我们通过实测数据，将Nanopore与Illumina平台进行比较，发现Nanopore测序数据的GC含量偏好性要明显小于Illumina，因此，ONT平台可以更真实的反映生物体内转录本的表达情况，定量更为准确。
GC偏好性图
综上，我们不难发现，ONT全长转录组在转录本定量和全长序列信息上有压倒性优势，这是二代转录组无法实现的。或许有老师会问，转录本定量有什么用？全长转录组的结果数据怎么用到文章中？不妨看看下面这个图[2]，两种情况下鉴定到的差异表达基因A和B，以及这2个基因鉴定到的各转录本差异表达情况。DGE表示差异表达基因，DTE表示差异表达转录本。可见，对于B基因，虽然基因水平并没有显著差异表达，但是转录本水平，B.1和B.2都发生显著变化，并且呈“此消彼长”的变化趋势。生命体可能通过控制不同转录本的表达来调控功能性蛋白的合成。
两个水平差异分析展示
下一期，我们将围绕全长转录组在动植物学研究中的应用方向进行全面展示，敬请期待。
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文：西早
排版：市场部
参考文献：
[1] Parker M T , Knop K , Sherwood A V , et al. Nanopore direct RNA sequencing maps the complexity of Arabidopsis mRNA processing and m6A modification[J]. Elife Sciences, 2020, 9:e49658.
[2]Froussios K , Kira Mourão, Simpson G , et al. Relative Abundance of Transcripts (RATs): Identifying differential isoform abundance from RNA-seq[J]. F1000 Research, 2019, 8:213.
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