（文章篇）S4E08: 新鲜出炉的JCI
----------“小张讲故事”之天方夜谭
据说，有那么一天啊，大夫们都陆续或改了行或出了国。还在国内打拼的，不是成了绣娘就是成了猪肉王子，要不就成了打铁的在卖锄头。有天，梦熊的哥们虎子突然病了，度娘了许久不见效。虎子找到了我，我就趁着夜色偷偷摸摸带着他，七绕八拐到了一家裁缝铺，找到了那个带着眼镜噘着嘴，在昏暗的灯光下认认真真缝着衣服的大妈。大妈看到我跟虎子来了，就放下针线。大妈检查了半响说：你这病已经转移了，这刀我开不了，隔壁的王铁匠怕也不行。这得要到陈家村请卖风筝的老陈才行。要是他也开不了，那只能请老陈在城里买烧烤的师傅了。哦，对了，记得麻醉要找漳江码头扛麻袋的裴老头做，给他瓶65°的二锅头就行。药的话在淘宝上买，店家名叫*****。“嘘。。。”，我突然低声说道。此时，只见一位脸色蜡黄的老者走了过来，我心里一惊，这不是原来的*纪委老牛吗。老者探过身来低声询问道：此处可有大夫？我跟大妈同时摇头：没有！
今天是国际护士节，“小张聊科研”向奋战在一线，不畏艰苦，救死扶伤，并与医*斗智斗勇的白衣天使们致敬，向“提灯女神”南丁格尔女士致敬！
今天分享一篇LncRNA的文章：cAMP/CREB-regulated LINC00473 marks LKB1-inactivated lung cancer and mediates tumor growth.J Clin Invest. 2016 May 3. （全文下载链接：http://pan.baidu.com/s/1nvb8ToH 密码: f44n）
作者发现了一个核内lncRNA，LINC00437。LKB1功能失活/沉默能引起LINC00437高表达，随之促使CRTC/CREB激活转录，使得肿瘤细胞生长。
本文，主要进行了相关验证，调控通路及功能研究。我们主要分析后面两个部分。
本文有三部分实验使用了NanoString数字基因表达谱技术，关于NanoString-based assay敬请期待小张带来的详细解说。
1、 发现并验证LINC00473
2、NSCLC中，LINC00437表达水平的提升与LKB1失活密切相关
作者使用了NanoString数字基因表达谱技术来检测LKB1相关基因的表达情况。
LINC00437的两个亚型在LKB1野生型NSCLC细胞系中是低表达或不表达的。而在LKB1突变细胞系中，这两个亚型的表达量则显著增加。
过表达SIKI能提升LINC00437在突变LKB1的NSCLC细胞系中的增强表达幅度。
3、 检测石蜡包埋样本RNA，发现在部分NSCLC中，LKB1基因编码区的突变引发LINC00437表达上升， LKB1其他位置突变并不能引起LKB1功能丧失，LINC00437表达也无变化。
4、 在肺腺癌中，LKB1突变参与LINC00437上调表达，并且LINC00437表达上调跟不良预后相关。
5、通路：LKB1缺失诱导CRTC/CREB激活促进LINC00437表达的。
LNC473转录水平跟LKB1呈负相关。LKB1沉默了，能促进LNC473表达。
前期报道，LKB1能调控下游AMPK家族成员，影响多条通路。在肺癌和食管癌中，LKB1沉默后，能使得CRTC转录共激活因子去磷酸化并且进入细胞核，随后CREB介导转录激活。
为了验证LKB1缺失诱导CRTC/CREB激活并促进LINC00437表达。作者首先干扰了CRTC/CREB作用，能明确发现LINC00437的转录水平降低。
并且，LKB1过表达能抑制LINC00437的表达。这说明了，LKB1缺失及CRTC/CREB激活调控LINC00437表达。
接下来，作者通过荧光素酶报告基因，调节LKB1/CRTC/CREB通路，检测LINC00437启动子活性。作者发现，过表达LKB1后，LINC00437启动子报告基因显著被抑制。而且表达A-CREB（显性负相突变，能特异性抑制CREB结合到DNA上）也能抑制启动子活性。而过表达CRTC1能提升启动子活性。
ChIP分析表明，CRTC/CREB能在LINC00437启动子区富集，形成cAMP响应元件位点。
6、第二部分已知，高表达LINC00437和较差的预后相关。作者认为，有可能LINC00437在肿瘤生长中起到一些关键作用。
细胞实验发现，沉默掉LNC437能显著，降低LINC00437转录水平。另外，敲减掉LINC00437能减少细胞增殖，提高细胞凋亡。
所以，LINC00437是促进LKB1失活细胞的生长存活必要条件。
动物实验表明，沉默LNC00437能显著抑制小鼠体内肿瘤的生长、大小，并且能抑制小鼠体内肿瘤细胞的数量。
7、LINC00437是一个核内lncRNA，通过结合NONO调控基因表达，调节CRTC/CREB转录。
前面通过RNA原位杂交发现，LINC00437是在核内定位。作者作了一下验证：
作者通过RNA pull-down实验，拉下LINC00437作用蛋白。其中NONO作为CRTC结合蛋白也被拉下来。并通过WB实验，确认了LINC00437与NONO的直接结合方式。并通过RIP、qRT-PCR证实了NONO是LINC00437的作用蛋白。
在cAMP刺激下，NONO能作用于CRTC共激活因子，而这也是CREB介导转录所必需要的。而上述证实LINC00437能直接作用于NONO，所以作者认为LINC00437调控NONO富集到CRTC，随之促进CREB靶基因转录。下图可见，沉默掉lnc437能抑制CRTC1报告基因活性，而过表达则能提升CRTC1报告基因活性。
验证：LINC00437缺失后，能降低CRTC/CREB一些靶基因表达。
完成了一个调控网络的验证。
好了，就这样吧。
世界就是这个样，所以我们都有英雄情结。有能力的去改变世界，让世界变得美好。没有能力的，要相信世界一定会变得美好。
That’s all. Thank you!
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