（文章篇）S4E13: 不怕烧脑就来，八个分子能不能把你绕晕？
大家好，有朋友请我们讲一篇lncRNA与代谢疾病有关的文章，所以，我们选了这篇：
A liver-enriched long non-coding RNA, lncLSTR, regulates systemic lipid metabolism in mice.Cell Metab（IF 17.5）. 2015 Mar 3;21(3):455-67.（下载链接：http://pan.baidu.com/s/1i4SnVPN 密码：mpsv）
按照惯例，先看机制图：
这个图看着有些复杂，一共涉及到了 lncLSTR、TDP-43、Cyp8b1、MCA/CA、FXR、apoC2、LPL和TG这八个分子，我们按照分子间的调控关系把内容拆解成五部分：
lncLSTR是文章新分子，与TDP-43直接结合；
TDP-43是Cyp8b1的转录抑制因子，与lncLSTR结合后解除对Cyp8b1的转录抑制；
Cyp8b1是胆汁酸合成中的限速酶，决定了胆汁酸MCA/CA（胆酸）的比例；
肝脏里胆汁酸的主要受体是FXR，而FXR的活性影响了apoC2的表达；
apoC2是LPL（lipoprotein lipase，脂蛋白酯酶）的激活分子，LPL可以水解TG（甘油三酯）。
看起来很复杂，不过第2、3、4、5点都是已知的研究背景哦，所以看起来蛮很简单，不过实际上非常复杂，因为每一步都要做选择题，假如每步选对的概率是1/2，五步下来概率就只有1/32，即3%左右了，这也是发高分文章难的地方，因为我们看到的数据只是冰山一角，大部分的阴性结果都没有展示。好了，我们看作者怎么一步步展开研究的：
1. 确定lncLSTR对脂代谢的影响：lncLSTR敲减促进TG降解。
通过分析别人的芯片结果，找到了在肝脏中富集表达的12条lncRNA，其中3条是肝脏特异性表达的；
检测3条lncRNA受小鼠饮食表达影响，然后确定lncLSTR，命名liver-specific triglyceride regulator。
研究lncLSTR染色体定位、物种保守性、蛋白编码能力等，说明lncLSTR是一条标准的lncRNA；
构建lncLSTR KD小鼠，检测代谢产物变化，发现小鼠血浆中TG含量下降；
证明TG含量下降原因不是因为TG分泌少了，而是降解多了；
lncLSTR KD的腺病毒干预ApoE-/-小鼠（高脂血症），结果降低了小鼠血浆中TG含量（而不影响胆固醇含量）。
2. 明确lncLSTR敲减促进TG降解的原因：上调apoC2表达和提高LPL活性。
TG降解是由LPL介导的，而LPL表达水平无变化，但是LPL活性增加；
影响LPL活性的有：抑制因子如apoC3和激活因子如apoC2，而lncLSTR敲减只提高apoC2的表达；
双敲小鼠：apoC2敲减后逆转了lncLSTR敲减造成的apoC2的表达上调和TG含量下降；
Rescue实验：注射lncLSTR KD腺病毒，敲减lncLSTR本底表达，并同时表达截断的lncLSTR（使其不能被shRNA靶向），检测apoC2与TG含量发现lncLSTR KD表型被逆转。
3. lncLSTR以FXR依赖的方式调控apoC2表达。
肝细胞进行lncLSTR敲减，发现apoC2表达无变化，说明lncLSTR调控apoC2表达不是通过自分泌方式进行；
再次分析别人芯片中lncLSTR与mRNA共表达网络关系，胆汁酸代谢中的分子Cyp8b1、Cyp7a1等与lncLSTR表达最相关；
肝细胞中lncLSTR敲减后Cyp8b1表达下降，而Cyp8b1可以调解胆汁酸MCA/CA（胆酸）的比例；
FXR作为胆汁酸MCA/CA的受体，在肝细胞分别用MCA/CA处理后活性增加，表现为FXR下游基因表达被上调，而MCA促进apoC2表达的能力比CA更强；
双敲小鼠：FXR敲除后逆转了lncLSTR敲除导致的apoC2表达上调，LPL激活和降脂效果；
4. lncLSTR通过与TDP-43结合调控Cyp8b1转录。
对lncLSTR进行细胞内定位检测，发现lncLSTR定位于细胞核，说明在转录水平而非转录后水平发挥功能；
通过RNA pull-down+质谱对与lncLSTR结合的蛋白进行鉴定，发现了RNA/DNA结合蛋白TDP-43，并通过RIP实验反向验证TDP-43与lncLSTR结合；
TDP-43敲减后逆转了 lncLSTR导致的Cyp8b1表达上调；
前期研究称TDP-43是Cyp8b1的转录抑制因子，而lncLSTR部分解除了TDP-43对Cyp8b1启动子的抑制作用；
明确TDP-43结合Cyp8b1启动子的位置和对启动子的直接结合；
CHIP确定lncLSTR对TDP-43结合Cyp8b1启动子的影响；
这篇文章由这四个主题组成，最后我们总结下我们可以学习的地方：
1. 用好生物信息学：确定lncRNA的切入点有很多，总结起来一般包括方面：差异和预测，构建好功能模型然后进行差异检测，或者直接从生物信息学出发，这两部分的文章我们都有遇到，这篇文章先从信息学分析出发再进行功能验证；另外，在后面确定下游分子机制时，还是通过对数据库中的结果进行分析来确定胆汁酸代谢分子Cyp8b1、Cyp7a1的，因此好的生物信息学技能非常有用。
2. 这篇文章涉及到的分子非常多，不过有不少内容我们以前提到过：
转录抑制因子TDP-43与Cyp8b1启动子的结合验证方式（蛋白与DNA的作用）；
通过共表达网络（network）关系挑选基因；
lncLSTR与TDP-43结合的验证方式（RNA与蛋白的作用）；
lncLSTR下调TG方式的确定：抑制产生还是促进降解；
lncLSTR对LPL的影响：不影响表达，却影响活性；
分子定位对于调控关系的初步确定：定位于细胞核，转录水平调控；
等等。
还有文章里面多个地方出现的阴性结果，比如“肝细胞进行lncLSTR敲减，发现apoC2表达无变化”等，作者总能绝处逢生，我们可能就放弃了。
3. 最后，如果作者能继续研究 lncLSTR与TDP-43结合的序列及结构域，并阐明 lncLSTR对TDP-43调控的具体方式，就更好了。
That’s all. Thank you!
请关注“小张聊科研”：搜索微信号“xzlky2015”，或长按二维码识别关注。
↓↓↓