国科金lncRNA和自噬，两个热点应该怎么串？

lncRNA和自噬无疑是现在非常火热的两个主题，今天给大家推荐一篇文章是最近刊登于Cell Death Differ的一篇文章，对于国自然标书写作，其研究方法、意义都有很重要的参考价值。

还记得上次小张讲过国科金写作，如何根据疾病选信号通路？（点击查看），另外之前有一篇（文章篇）S5E33：RNA甲基化，从一篇PNAS到基金课题设计（点击查看），那么今天的这篇文章，仔细看应该会有很大收获。

The lncRNA HOTAIRM1 regulates the degradation of PML-RARA oncoprotein andmyeloid cell differentiation by enhancing the autophagy pathway.（Cell Death Differ. 2016 Oct 14.IF8.2）

下载链接：http://pan.baidu.com/s/1gf2YXqj

这是中山大学陈月琴教授课题组的一篇lncRNA研究的文章。我们在昨天的lncRNA研究大神，看看你都认识谁，之二（点击查看）介绍过陈教授，陈教授主要从事非编码RNA与疾病相关的研究。

在该研究中，陈教授团队第一次报道了lncRNA-HOTAIRM1调控自噬以及在骨髓细胞分化阻滞过程中降解肿瘤蛋白PML-RARA，并暗示着该lncRNA是白血病的一个潜在治疗靶点。

HOTAIRM1能通过自噬通路调控骨髓细胞分化，并降解肿瘤蛋白PML-RARA。lncRNA-HOTAIRM1在不同细胞中，存在不同丰度的表达变异体，在急性早幼粒细胞白血病（APL）病人中其表达模式与肿瘤蛋白PML-RARA相关。下调HOTAIRM1能抑制APL细胞全反式维甲酸诱导的PML-RARA降解，阻滞早幼粒细胞至粒细胞分化过程。并且发现，HOTAIRM1能调控自噬，当下调HOTAIRM1时细胞中的自噬体形成受到抑制。通过荧光素酶报告基因实验、RIP、RNA pull-down发现HOTAIRM1通过miRNA sponge功能吸附miR-20a、miR-106b、miR-125b。

主要内容：

1、确定骨髓细胞中的HOTAIRM1的剪接体

HOTAIRM1是HOXA基因簇反转录形成的483nt的lncRNA。通过Ensembl数据库发现，HOTAIRM1有5个不同的剪接体。

接着用ATRA处理NB4细胞，发现其中HOTAIRM1-1、3、5要比HOTAIRM1-2、4表达量要高。研究团队在下面的实验中，主要开始关注HOTAIRM1-1、3、5。

ATRA能诱导NB4细胞分化，当敲减HOTAIRM1时，分化作用减弱。同时，在临床上发现，AML-M3-CR病人（完全缓解）HOTAIRM1的丰度要高于AML-M3病人。

前期已经报道了肿瘤蛋白PML-RARA对APL发生发展起到很重要的作用，而HOTAIRM1却似乎能在预后起正相关作用。研究团队就想了解一下他们俩之间是否存在相关性。

实验发现，在AML-M3-CR中，肿瘤蛋白PML-RARA的水平显著降低，且PML-RARA的表达与HOTAIRM1的三个剪接体成负相关。

所以，作者们猜测下调HOTAIRM1对PML-RARA影响APL发生过程中细胞分化有很重要的作用，或者影响治疗诱导的PML-RARA的清除。

2、在APL细胞中，HOTAIRM1能增强ATRA诱导的PML-RARA降解

接着研究团队思考，HOTAIRM1与PML-RARA之间是否有相互调控的关系。

U937-PR9细胞系，携带有PML-RARA基因，能通过硫酸锌进行诱导。实验中通过诱导（过表达）PML-RARA或干扰它，对HOTAIRM1的表达水平无明显变化。而干扰掉HOTAIRM1后，则PML-RARA水平则显著调高，这表明HOTAIRM1能调控PML-RARA，PMLRARA对HOTAIRM1起不到调控作用。

干扰HOTAIRM1后，粒细胞表面markerCD11b下降，这表明APL病人中低表达HOTAIRM1能提高PML-RARA表达，促进粒细胞分化。

到此，其中涉及到的通路还未明确。

3、确定HOTAIRM1调控PML-RARA的方式及通路

前面我们已经了解过，lncRNA调控下游靶分子的表达主要通过几个层次，转录前、转录后、翻译前、翻译后。在翻译后调控途径中有一个最经典的方式是降解作用。

国科金写作，lncRNA的机制该怎么设计？（点击查看）一文中，刚刚开始我们就提到：lncRNA最最经典的竞争性内源RNA（ceRNA）的作用模式。lncRNA通过碱基互补配对吸附miRNA（miRNA sponge），使得miRNA功能丧失或降低（loss-of-function），ceRNA作用机制主要是影响了miRNA的丰度。

通过DIANA TOOLS、BiBiServ2-RNAhybrid软件，作者们预测到了HOTAIRM1有三个miRNAs的结合位点，三个miRNA分别为miR-20a、miR-106b、miR-125b。

很巧的是，前期报道了这三个miRNA分子通过靶向一些自噬基因，从而参与了自噬相关信号通路。

通过透射电子显微镜发现，在干扰HOTAIRM1细胞中，自噬体的形成受到了抑制。激光共聚焦显微镜也证实自噬作用减弱。

WB检测自噬溶酶体相关蛋白LC3B-II、 GABARAP-II、p62的表达，发现LC3B-II、 GABARAP-II的蛋白水平在干扰HOTAIRM1细胞中被抑制了，而其mRNA水平是没有显著差异的。

荧光素酶报告基因实验，证实HOTAIRM1参与自噬体的形成。

最后，使用自噬抑制剂和诱导剂验证了之前的猜想，下调HOTAIRM1能减弱自噬作用，并抑制NB4细胞中的PML-RARA蛋白降解。

上面讲到HOTAIRM1通过增加自噬体的形成来增强PML-RARA蛋白的降解，这或许暗示着在自噬通路中HOTAIRM1作为ceRNA的功能。

通过RNA pull-down，检测到AGO2与HOTAIRM1结合，反过来通过RIP检测HOTAIRM1与AGO2也结合。通过荧光素酶报告基因确定了HOTAIRM1与miR-20a、miR-106b、miR-125b结合。

前期已经报道ULK1、 E2F1、DRAM2分别是miR-20a、miR-106b、miR-125b的靶蛋白，参与自噬过程。

双荧光素酶报告基因分析，HOTAIRM1-siRNA能抑制miR-20a、miR-106b、miR-125b靶基因的翻译。

所以，HOTAIRM1通过miRNA微调整机制来调控自噬基因及下游信号通路。

并且，干扰HOTAIRM1能提升miR-20a、miR-106b、miR-125b水平，导致PML-RARA蛋白上调。这表明，HOTAIRM1通过miRNA介导的通路抑制自噬相关基因调控PML-RARA蛋白降解。

4、动物实验

抑制HOTAIRM1能阻遏PML-RARA蛋白水解，抑制早幼粒细胞分化。

想了解详细内容，请阅读文章全文。

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