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外泌体是好,可是这个关键点你知道吗?

2016-12-20 梦熊 小张聊科研


作为一个日益火爆的研究载体,外泌体在近年来国自然标书的地位日益显著,出现频次也越来越高。

除了前期的工作基础就是研究外泌体之外,我们应该如何适当地从分子研究层面来引入外泌体呢?


今年部分关于外泌体中标的国自然基金



一、经典套路


下面以二军大王红阳院士的一篇Cancer Cell为例:


Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA.Cancer Cell. 2016 May 9;29(5):653-68. doi: 10.1016/j.ccell.2016.03.004. Epub 2016 Apr 21.




外泌体介导lncRNA-ARSR竞争性结合miR-34、miR-449,促进后者靶基因的表达,进而激活了AKT通路;同时AKT能磷酸化FOXO家族及降解;FOXO家族能在lncARSR启动子区富集,形成转录抑制。展开来看包括以下两部分:


1)在苏尼替尼耐药RCC细胞中,lncARSR通过竞争性结合miR-34、miR-449,上调AXL、c-MET表达,激活STAT3、AKT、 ERK通路,从而使得RCC细胞耐药。另外,激活AKT能诱导FOXO1、FOXO3a磷酸化及降解,其结果导致lncARSR在转录上去抑制,从而形成了一个正向反馈回路。


2)lncARSR可以被包进外泌体中,并且可以由苏尼替尼耐药的RCC细胞分泌,传播耐药性到受体细胞中。


套路:

  1. 前期工作基础我们研究了某个miRNA,它能抑制疾病进程:比如在肿瘤细胞该miRNA是下调表达的,其能抑制细胞的迁徙、转移、增殖等表型作用,那么我们认为该miRNA具有抑制肿瘤进展的作用。

  2. 我们预实验发现其受到某条lncRNA吸附,从而使得丰度下降,促进下游靶蛋白表达。

  3. 引入外泌体,发现其通过传递lncRNA,使得靶细胞中的lncRNA上调,miRNA的丰度受到抑制,从而促进肿瘤的进展。


这里是按照microRNA-lncRNA-外泌体这个顺序来说明的,即先证明microRNA的功能;然后看microRNA低表达的原因:被lncRNA吸附;最后说明外泌体对lncRNA的包埋和传递。第一、二点中 microRNA的功能lncRNA对microRNA的调控我们比较熟悉。下面我们重点说一个关键问题:


二、lncRNA(或者RNA)是如何进入外泌体中的?


外泌体对lncRNA的包埋和传递,即:外泌体中的含量高的RNA是否与细胞浆含量高的RNA一致?是什么因素决定RNA在外泌体中富集的?


这个问题决定了你的科学假说是否在理论上正确。在Cancer cell这篇文章中发现:有一类核不均一核糖核蛋白(hnRNPA2B1),它能结合lncRNA或miRNA特异性的序列(GGAG/CCCU),进行主动包埋。



再比如这篇文章:


Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs.Nat Commun. 2013;4:2980. doi: 10.1038/ncomms3980.


文章有两个有意思的发现:


1. 不同的miRNA或mRNA在细胞浆与外泌体中的分布比例是不同的miR-575、miR-451、 miR-125a-3p、miR-198、 miR-601、 miR-887等在外泌体中的含量要高,而miR-17、 mir-29a、 let-7a、miR-142-3p、miR-181a 、 miR-18a在细胞浆中的含量高。


2. miR-575、miR-451等外泌体中的microRNA是通过GGAG这段特异性序列与hnRNPA2B1结合,主动进行外泌体包埋。


在以上的两篇文章中,我们看到核不均一核糖核蛋白(hnRNPA2B1)在介导RNA包埋到外泌体中起到了关键作用,而RNA需要含有GGAG/CCCU这样的保守序列。因此,为了证明这一点,我们需要完成这三个实验:


1. 过表达RNA或者hnRNPA2B1后,外泌体中对应的RNA含量升高;


2. hnRNPA2B1被沉默(抑制)后,外泌体中对应的RNA含量降低乃至消失,但是胞浆的RNA变化不显著;


3. 将RNA中的GGAG/CCCU进行突变,即使hnRNPA2B1存在,我们仍然不能在外泌体中检测到原有丰度的RNA。



最后,祝大家多拿外泌体相关的项目!



That's all. Thank you!


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