外泌体是好，可是这个关键点你知道吗？
作为一个日益火爆的研究载体，外泌体在近年来国自然标书的地位日益显著，出现频次也越来越高。
除了前期的工作基础就是研究外泌体之外，我们应该如何适当地从分子研究层面来引入外泌体呢？
今年部分关于外泌体中标的国自然基金
一、经典套路
下面以二军大王红阳院士的一篇Cancer Cell为例：
Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA.Cancer Cell. 2016 May 9;29(5):653-68. doi: 10.1016/j.ccell.2016.03.004. Epub 2016 Apr 21.
外泌体介导lncRNA-ARSR竞争性结合miR-34、miR-449，促进后者靶基因的表达，进而激活了AKT通路；同时AKT能磷酸化FOXO家族及降解；FOXO家族能在lncARSR启动子区富集，形成转录抑制。展开来看包括以下两部分：
1）在苏尼替尼耐药RCC细胞中，lncARSR通过竞争性结合miR-34、miR-449，上调AXL、c-MET表达，激活STAT3、AKT、 ERK通路，从而使得RCC细胞耐药。另外，激活AKT能诱导FOXO1、FOXO3a磷酸化及降解，其结果导致lncARSR在转录上去抑制，从而形成了一个正向反馈回路。
2）lncARSR可以被包进外泌体中，并且可以由苏尼替尼耐药的RCC细胞分泌，传播耐药性到受体细胞中。
套路：
前期工作基础我们研究了某个miRNA，它能抑制疾病进程：比如在肿瘤细胞该miRNA是下调表达的，其能抑制细胞的迁徙、转移、增殖等表型作用，那么我们认为该miRNA具有抑制肿瘤进展的作用。
我们预实验发现其受到某条lncRNA吸附，从而使得丰度下降，促进下游靶蛋白表达。
引入外泌体，发现其通过传递lncRNA，使得靶细胞中的lncRNA上调，miRNA的丰度受到抑制，从而促进肿瘤的进展。
这里是按照microRNA-lncRNA-外泌体这个顺序来说明的，即先证明microRNA的功能；然后看microRNA低表达的原因：被lncRNA吸附；最后说明外泌体对lncRNA的包埋和传递。第一、二点中 microRNA的功能和lncRNA对microRNA的调控我们比较熟悉。下面我们重点说一个关键问题：
二、lncRNA(或者RNA)是如何进入外泌体中的？
外泌体对lncRNA的包埋和传递，即：外泌体中的含量高的RNA是否与细胞浆含量高的RNA一致？是什么因素决定RNA在外泌体中富集的？
这个问题决定了你的科学假说是否在理论上正确。在Cancer cell这篇文章中发现：有一类核不均一核糖核蛋白（hnRNPA2B1），它能结合lncRNA或miRNA特异性的序列（GGAG/CCCU），进行主动包埋。
再比如这篇文章：
Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs.Nat Commun. 2013;4:2980. doi: 10.1038/ncomms3980.
文章有两个有意思的发现：
1. 不同的miRNA或mRNA在细胞浆与外泌体中的分布比例是不同的：miR-575、miR-451、 miR-125a-3p、miR-198、 miR-601、 miR-887等在外泌体中的含量要高，而miR-17、 mir-29a、 let-7a、miR-142-3p、miR-181a 、 miR-18a在细胞浆中的含量高。
2. miR-575、miR-451等外泌体中的microRNA是通过GGAG这段特异性序列与hnRNPA2B1结合，主动进行外泌体包埋。
在以上的两篇文章中，我们看到核不均一核糖核蛋白（hnRNPA2B1）在介导RNA包埋到外泌体中起到了关键作用，而RNA需要含有GGAG/CCCU这样的保守序列。因此，为了证明这一点，我们需要完成这三个实验：
1. 过表达RNA或者hnRNPA2B1后，外泌体中对应的RNA含量升高；
2. hnRNPA2B1被沉默（抑制）后，外泌体中对应的RNA含量降低乃至消失，但是胞浆的RNA变化不显著；
3. 将RNA中的GGAG/CCCU进行突变，即使hnRNPA2B1存在，我们仍然不能在外泌体中检测到原有丰度的RNA。
最后，祝大家多拿外泌体相关的项目！
That's all. Thank you!
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