开启写轮眼看穿质粒的神秘图谱
最近有童鞋在后台留言“质粒是谁？它来自哪里？它要去哪儿？”，对质粒图谱无法正确读取。
诚然，这种感觉就好比小师妹整天嚷嚷着“皮皮虾，我们走”“皮皮虾所不能承受之重”，斗图斗得可溜了，结果昨晚真的请她去吃皮皮虾了，第一次见到皮皮虾的她被吓得一个劲儿地往角落里躲，知其然不知其所以然！
正好X湿兄对质粒略知一二，开启你的写轮眼，一起来了解一下质粒的前世今生吧。
一、分子遗传学的起源—质粒
“如果孟德尔的豌豆实验标志着基因概念的诞生，那么质粒载体的发现则象征着分子遗传学的起源。”这句话对质粒的赞美其实是毫不夸张的。
孟德尔的豌豆实验之后的100年时间里，越来越多有意义的生物实验证明：基因编辑了蛋白，而且基因就依附在染色体上。染色体就是遗传信息DNA，DNA借由转录本RNA翻译为蛋白质，行使功能，这就是中心法则（Central Dogma）。
但其实不然，有些基因信息还可以存在于染色体外，1952年Joshua Lederberg创造一个词儿“质粒(Plasmid)”，指的是任何染色体外的遗传决定物质，共价、闭合、环状双链DNA（cccDNA），大小从1kb~1000kb。质粒是一种独立于染色体外独立复制的双链DNA片段，通常都含有基因。尽管质粒在细菌、古细菌和真核细胞中都有发现，但质粒对于细菌的生物学意义更加重要，因为细菌与细菌之间可以通过鞭毛等相互交换质粒信息，而这种遗传信息的交换是有利的，因为质粒上面含有耐药基因等信息。不过别人的遗传信息不要轻易接收，除非有下图的功能。
腰不酸了腿也不疼了走路也有劲了
上世纪70年代，限制内切酶、DNA连接酶和凝胶电泳实验让特定的DNA片段从染色体上转移到质粒载体上来研究功能成为可能，这个过程叫“分子克隆”。分子克隆的过程允许科学家们将染色体断裂，单独研究它们的基因，这标志着分子遗传学的诞生。分子克隆有点像《火影忍者》里的写轮眼，写轮眼好比基因，眼睛的受体好比质粒，既挖即装即生效，也不排斥，生物学家的掌中宝。
二、质粒减肥史—玉不琢不成器
天然存在的野生型质粒分子量大(＞15kb)、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求。你想象一下，万米跑中，一个从来不跑步、却穿着皮鞋的400斤大胖子，和一个训练有素、跑步装备适宜的小瘦子，哪个跑第一的可能性更大一点？（没有歧视胖子的意思，别打我，打人也别打脸）
那么如何让这个大胖子跑第一呢？那就是改造！首先得让这个大胖子减肥，把多余的肥肉减下来到合适的体重；然后给他提供一整套合适的跑步装备，周而复始地训练。同样的道理，质粒必须改造才能成为生物学家的工具：
①减肥，把多余的和功能研究无关的片段删除掉，15kb→1~5kb
②给它合适的装备，安装各种酶切位点以及遗传标记，例如抗性基因（氨苄霉素、卡那霉素、四环素…）、报告基因（luciferase、EGFP…）等。
这样改造后的质粒才是咱们平常实验室的质粒载体，用起来就溜了。
三、质粒载体在科研中的用途—八仙过海各显神通
① 克隆载体：能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体，这类载体没有启动子等启动转录、翻译的元件。
② 表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA序列。(X湿兄以前用过pET系列的表达过蛋白质并纯化， pET表达载体系列使用了T7启动子，对于蛋白的表达特别强烈，宿主菌的70%的资源都被调用来生产目的蛋白，有时候也挺心疼宿主细胞的，X湿兄觉得对不起这些宿主菌了，想想这些宿主菌除了保证自己的基本性命之外，一直在干活。。。。。。这也是为何生产蛋白的企业喜欢pET系列载体的原因，每升的培养基可产出几克的目的蛋白。)
被转染了质粒的细胞，像极了加班中的你
③ 基因下调载体：用于减少某个内源基因的表达，该载体上含有针对目标基因mRNA的shRNA，起到基因沉默的作用，下调基因的蛋白表达。
④ 病毒质粒：基于病毒的基因组改造而成的质粒，可以独立包装成为病毒颗粒，巧妙地去除了病毒的感染致病性却保留了病毒的其他功能，为功能基因的灵活进入细胞并整合到基因组中提供了非常方便的工具。
四、质粒载体的正确解读—写轮眼开启
质粒的命名：举个栗子，pUC19、pEGFP-N3。小写字母p代表质粒”plasmid”，2~4个大写字母代表发明者、实验室名称或者其他表型性状（EGFP是增强型绿色荧光蛋白）。
质粒图谱的解读：
① 复制起始位点Ori，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）：招募复制蛋白，进行质粒的自我复制，增加拷贝数，随着细胞的增殖而增殖；
② 抗性基因：有些童鞋会问为何要往培养基里面加抗生素？质粒为何要有抗性基因？因为质粒对于一般细胞来讲不是必需元件，在没有抗生素的培养基中不断增殖的过程中，质粒载体慢慢就丢失了，只有培养基里面加入抗生素，抗性基因赋予宿主菌分解抗生素的能力，细胞才会需要该质粒。
这就好比在和平年代，武器不被需要，但是上战场就得拔枪射杀敌人保护自己的道理一样，这质粒就相当于是机枪，给予细胞在抗生素环境中存活下来的条件。这样咱们研究的功能基因才能够在每个细胞中存在。
Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
tetr 可以阻止四环素进入细胞。
camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活
③ 看多克隆位点（MCS）：它具有多个限制内切酶的单一切点（质粒上只能有该内切酶的唯一酶切序列，不然就一刀好几段了），便于咱们要研究的基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选，最常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统（自行百度百科）。
如果某个内切酶的酶切序列有好几个，会被乱刀砍成好几段的
④ 是否含有表达系统元件，即启动子（promoter）－核糖体结合位点（RBS）－转录终止信号（AATAAA同时是poly A）。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
⑤ 报告基因：例如β-半乳糖苷酶、EGFP、luciferase等，便于迅速检查功能基因是否表达的阳性判断，表达成功的蛋白在小鼠体内分布位置，直接看EGFP、luciferase的荧光就ok。
⑥ 引物结合区（primer）：一般位于多克隆位点区的上、下游，便于通用引物的PCR验证、测序验证之用。
可能有些童鞋会问：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表DNA两条链（正义链和反义链），即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。
五、质粒载体获得的途径
质粒载体可以无限扩增，所以大部分质粒都可以相互转赠的，实验室与实验室之间，或者看到哪个paper里有提到这个质粒，联系作者索取。如果实在找不到，就去生物论坛询问，有的免费，有的出点小钱，或者联系一些小公司，一般问题不大。
但是，但是，但是，重要的事情说③遍，拿到质粒载体之后一定要去测序公司测个序，验证该质粒的真伪或者是否有突变，再开始做实验，否则错的质粒做到最后才发现的感觉就好比：好不容易把孩子拉扯大了，却发现不是亲生的。
质粒的标准图谱推荐到上查询。
That's all. Thank you!
请长按二维码识别关注“小张聊科研”。
关注后获取《科研修炼手册》1.0、2.0、3.0、基金篇精华合集。