二军大孙树汉教授Hepatology发表最新成果

第二军医大学遗传学教研室的孙树汉教授是肝癌发生发展及转移过程中lncRNA研究的大牛，每年都有lncRNA相关研究的高分文章产出。在上个月，Hepatology见刊了一篇孙教授关于RNA甲基化修饰的文章，这或许是孙教授团队除lncRNA之外的另一个研究出发点。本文另一作者周伟平教授也是lncRNA研究领域的专家，之前小张聊科研也做了相关介绍。（lncRNA研究大神，看看你都认识谁？点击查看）

本文报道了METTL14通过调控m6A依赖性初级miRNA（成熟）进程从而抑制肝癌的转移能力。

背景介绍：

首先我们先了解：什么是RNA甲基化修饰？((主题篇)S5E31：一文了解RNA甲基化的来龙去脉，点击查看)

最常见的RNA的甲基化修饰是m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）和尿苷化修饰（uridylation，U-tail）。

m6A修饰在70年代就发现了，是可以发生在mRNA、lncRNA等RNA的腺嘌呤（A）上的甲基化修饰，在哺乳动物中，发生 m6A修饰的腺嘌呤A比例为0.1–0.4%，算起来每条mRNA只有3-5个m6A甲基化位点。

哺乳动物和酵母中的m6A位于mRNA终止密码子附近和3’非翻译区。RNA修饰能够在转录后水平上调控RNA的稳定性、定位、运输、剪切和翻译，比如mRNA的翻译和选择性剪接，microRNA的成熟等。

DNA和组蛋白的表观遗传学修饰主要在转录水平上起作用。而可逆的RNA甲基化主要在转录后水平上调控基因表达。

其次，RNA甲基化修饰的参与者有哪些？

在RNA甲基化修饰过程中，有三类分子参与其中:Writers, Erasers和Readers。

其中Writers是将甲基化修饰“写入”RNA，即介导RNA的甲基化修饰过程。最常见Writers分子是METTL3和METTL14，两者可在体外和体内催化mRNA（和其他细胞核RNA）的m6A甲基化。WTAP是这种甲基转移酶复合体中的另一个关键组分。

那么，可以看出本文说的是，使用常见的RNA甲基化修饰Writers分子METTL14通过调控miRNA成熟介导抑制了肝癌转移的能力。

主要内容：

本项目通过研究发现m6A修饰在肝细胞癌中是降低的，特别是在转移性肝细胞癌中其修饰更低。METTL14是参与m6A修饰的主要调控因子，此外METTL14的下调可作为肝细胞癌无复发预后的不利因素，并与体外和体内肿瘤转移存在显著相关。实验表明METTL14与DGCR8相互作用，并以m6A依赖性方式正向调节pri-miR-126过程。进一步的实 48 30632 48 14988 0 0 3908 0 0:00:07 0:00:03 0:00:04 3908表明，在肿瘤转移中microRNA-126能阻遏由METTL14产生的抑癌作用（实验表明，METTL14通过下游分子miR-126，实现调控HCC转移功能的）。

1、发现HCC（肝细胞癌）肿瘤样本m6A修饰异常

作者通过比色m6A定量法发现，在HCC中m6A修饰明显低于其对应的癌旁组织，且m6A在这两者中的修饰水平均低于正常的肝脏组织。

2、METTL14参与了m6A的异常修饰

研究团队通过检测了6种m6A修饰的催化蛋白，其中有METTL14、FTO这两种对m6A催化起相反作用的酶，在HCC中均显著低表达。接着通过大样本验证了METTL14在55%的样本中存在显著表达抑制，且与GEO数据库的GSE54236数据一致。鉴于两者的催化功能以及m6A修饰在HCC中是被抑制的，且METTL14作为m6A转移酶的活性组成，其表达与m6A修饰水平呈正相关。因此，作者后续只关注该分子。

且通过体外实验验证，干扰METTL14能降低HCC细胞株的m6A修饰水平；同时，挽救实验表明过表达METTL14能回复因METTL14缺失导致了m6A修饰水平降低。

3、METTL14与HCC临床相关性

通过大样本检测发现，METTL14在肝脏癌变过程中其表达是有减低趋势的，结合临床预后数据分析，发现METTL14的低表达会导致更为频繁的复发，以及更差的预后。同时，METTL14的异常表达，不仅仅与肿瘤分化、分期有关，还与肿瘤的封闭、微卫星以及微血管浸润有关。

门静脉癌栓PVTT是HCC转移的主要途径，其与肿瘤的恶性程度强烈相关。实验表明，METTL14在PVTT中的丰度比转移或非转移HCC中的表达量还要低。结合m6A修饰水平在转移性HCC中比非转移HCC中要低，表明了METTL14与HCC转移密切相关。

结合长期随访数据，METTL14表达与性别、HBeAg、微血管浸润有关。KM生存分析表明，METTL14下调与OS、RFS率呈负相关。

4、METTL14体外功能试验

通过细胞实验验证了，干扰METTL14能提升HCC细胞的转移能力。

过表达METTL14能抑制HCC细胞的浸润与转移作用。

5、METTL14依赖的m6A修饰的下游调控机制

前期已经报道了m6A修饰能通过以依赖于METTL3/m6A的作用，识别DGCR8标记初级miRNAs的进程，这表明改变METTL3/m6A能导致多种生物学进程中miRNAs的异常表达。那么作者考虑是否METTL14/m6A在肿瘤进程中是否也能调控pri-miRNAs。

通过Co-IP实验发现，METTL14与DGCR8结合，并且使用核酸酶能降低它们之间的结合作用，这暗示着两者间可能是通过RNAs结合的。

细胞实验发现，METTL14过表达细胞能显著提升与DGCR8结合的RNA甲基化，这或许表明METTL14通过调控DGCR8的识别与结合位点到pri-miRNAs，从而操控pri-miRNAs（与已报道的METTL3类似）。

随后，通过GEO数据库中相关芯片数据，采集转移与非转移HCC中差异表达的miRNAs，结合METTL14在HCC中表达抑制会导致相关miRNAs下调，筛选到了一些METTL14调控的候选miRNAs。接着通过检测METTL14干扰细胞中，这些候选miRNAs及其pri-miRNAs的表达丰度，发现miRNA-126在METTL14干扰细胞中表达显著下降。

前期已经报道了，miR-126在HCC中是起到转移抑制作用的。通过细胞实验发现，成熟的miR-126在METTL14干扰细胞中表达降低，而在过表达细胞中表达上升。同时，pri-miR-126则在METTL14干扰细胞中积累，而过表达细胞中pri-miR-126则加速成熟进程（消耗）。另外，在METTL14过表达细胞中，通过qRT-PCR检测到更多的pri-miR-126结合到DGCR8上；且IP实验表明，METTL14的过表达能提升pri-miR-126的m6A修饰。

实验表明，m6A修饰标志能增强DGCR8对pri-miR-126的识别，提升miR-126成熟进程。

6、miR-126的功能

通过细胞实验发现，过表达miR-126能抑制METTL14缺失细胞的转移功能，而miR-126抑制剂的加入能促进METTL14过表达细胞的转移能力。且在HCC样本检测，发现miR-126水平同样是降低的，与METTL14表达呈正相关。这表明，miR-126是通过m6A方式被METTL14调控的下游分子，并参与调控HCC转移。