蛋白互作鉴定宝典之-------Co-IP

蛋白相互作用在信号通路研究中较为常见，经典的方法有：CO-IP、GST-pulldown、酵母双杂交系统（研究蛋白互作，这三个经典实验你都知道吗？）。

今天，小编在这里跟大家主要交流一下CO-IP的实验原理、操作方法及注意事项。

一、实验原理：

CO-IP，又叫免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Z也能沉淀下来。

目前多用proreinA预先结合固化在琼脂糖微珠上，Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体的Fc区结合，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，琼脂糖微珠上的proreinA/G与抗体Fc特异性结合，由于抗体抗原特异性，沉淀蛋白X；溶液中有和蛋白X相互作用的物质，就能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

二、操作流程：

预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机

1、根据实验需要，对细胞进行处理（siRNA、过表达、药物刺激等）；

2、收集细胞，去除培养基后，用预冷的1xPBS洗涤细胞2次，最后一次吸干PBS，加入预冷的RIPABuffer(1ml/10⁷个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶；0.5ml/5×10⁶个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)；

3、用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，置于冰上；

4、4℃，14000g离心15min，立即将裂解液转移到一个新的1.5EP管中；

5、取少量裂解液以备Western blot分析（检测细胞内是否是有X蛋白的表达），加入一定体积的抗X蛋白的抗体（单克隆抗体或多克隆抗体，特异性要好）到剩余裂解液中，抗体的稀释比例因目的蛋白在不同细胞系中的多少而异；

6、4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h；

7、加入Protein A琼脂糖珠和ProteinG琼脂糖珠（建议将枪头减为粗口，避免伤害珠子）来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h；

8、14000rpm瞬时离心1min，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的PBS洗3遍，保留沉淀；

9、用20-60μl1×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物（四元复合物，Z蛋白-X蛋白-抗体-琼脂糖珠）悬起，轻轻混匀；

 10、将上样样品在99°C煮10min，然后在14000rpm瞬时离心5min；

11、将样品上样到SDS-PAGE凝胶上，用western blot进行分析。

三、注意事项：

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。

（2）使用对照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

 (3) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

(4) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

(5) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

四、常见问题

（1）protein的选择

注：protein A的载量高

Protein G可以结合更多种属和亚型的抗体，并且结合力更强

二者可以单独使用，也可以混合使用

（2）细胞裂解液的选择？

1%的NP40可以破坏掉细胞膜，获得胞浆蛋白

1%的TritonX-100可以破坏核膜，获得核蛋白

（3）如何避免重链和轻链的影响？

如果目标蛋白接近50KDa（与重链蛋白大小一致）的话，可以选择特异结合轻链的二抗，避免产生干扰结果（例如B图）；如果目标蛋白接近25KDa（与轻链蛋白大小一致）的话，可以选择特异结合重链的二抗，避免产生干扰结果。

尽管CO-IP作为研究蛋白互作经典方法之一，仍有一定的缺点：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用。

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