“师兄，help! help! 我的蛋白为什么一直检测不出来！”

一大清早，小师妹垂头丧气地走到大师兄跟前哭诉：“我最近好像中邪了，用WB检测某个膜蛋白，做了N次，老是检测不到相应的蛋白。抗体是商业化抗体，确认过没问题的。WB中用到的各种buffer也确认过没问题。上样量、抗体浓度、转膜时间等该调整的都调整了，还是检测不到相应蛋白，真的是欲哭无泪啊。师兄，你救救我吧！”大师兄悠哉悠哉地说：“事出蹊跷，其中必有妖。下次你孵抗体时不切膜，孵全膜，曝光曝全膜，看看神马情况？”

第二天，小师妹又沮丧地跟大师兄诉苦道：“什么鬼嘛，爆出来一团糊，目的条带还是不见踪影。”大师兄意味深长地说：“看来有戏，查查上样loading buffer的成分，看是否含有DTT/SDS？如果不含DTT/SDS的话，加入DTT/SDS做个浓度梯度，再跑WB试试。”

第三天，小师妹又一脸愁容的跑过来跟大师兄汇报：“都按你说的加了，然并没有卵用。”这次大师兄若有所思地问师妹：“你研究的具体是哪个膜蛋白？把它的氨基酸序列给我看看。”看完此蛋白的氨基酸序列后，大师兄胸有成竹地说：“你的蛋白是被煮没了，蛋白变性不要100℃煮，可以换成37℃ 1h或65℃ 30min。”

第四天，小师妹喜出望外地跑到大师兄面前报喜说：“师兄，你太神了，我终于终于检测到目的条带了！”“想知道这其中猫腻么？”大师兄问道，小师妹立马用力点点头，大师兄神情自若地说：“快搬个小凳子、小黑板过来，让我给你娓娓道来！这次实情是这样的，这是一种蛋白多聚化现象。”

1、形成蛋白多聚体的原因很多，如果一个蛋白的氨基酸组成——含有较多疏水性氨基酸（色氨酸W、丙氨酸A、缬氨酸V、亮氨酸L、异亮氨酸I、脯氨酸P、苯丙氨酸F等），蛋白疏水性很强，则蛋白煮了之后很容易形成聚集体，如 β-淀粉样蛋白就是其中一个典型的例子（见图1）。β-淀粉样蛋白中疏水氨基酸/总氨基酸比例是57%，对于这种富含疏水性氨基酸的蛋白，可以用37℃孵育1h，或者60℃ 30min代替boiling 5min。

（图1：Western blot detection of Abeta in brain extracts from APP/PS1 and APP/PS1 x C/EBPD(-/-) mice. Abeta protein loads in PBS-soluble）

2、此外，β-ME/DTT/SDS是体外解多聚的常用方法。连接多聚体单体的化学键主要有2种，一种为高浓度SDS敏感的非共价键，一种为对还原剂敏感的共价键。SDS是一种去污剂，可以破坏键能较小、不稳定的非共价键（如疏水键），而不能破坏键能较大、稳定高的共价键，因此在高浓度SDS中以非共价键连接的多聚体会解聚。而 β-ME/DTT都是还原剂，还原剂则可以破坏共价键（如二硫键），因此在还原环境中，以共价键连接的多聚体会解聚。催产素受体就是典型例子之一。在体外培养细胞中催产素受体在没有还原剂时主要以四聚体、三聚体和二聚体存在，当加入还原剂后，由于还原剂能够破坏连接单体的二硫键，导致多聚体解聚（见图2 ，图3）。

（图2：不同浓度的β-ME使OTR解聚，图源文献）

（图3：不同浓度的DTT使OTR解聚，图源文献）

听完大师兄的讲解，小师妹恍然大悟道：“哦哦，原来这只妖就是蛋白的多聚化！！！”大师兄怡然自得地说：“所以呢，以后WB死活做不出来的时候，何不妨考虑下是不是蛋白的多聚化现象呢？”

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