非洲猪瘟病毒（ASFV）是一类古老的病毒，1921年在非洲肯尼亚首次被发现，非洲猪瘟不是人畜共患病，不会感染人。非洲猪瘟病毒在环境中稳定，可以在猪之间快速有效地传播，并能够引起高接触性的急性出血热病，而且可感染所有品种和年龄的猪，发病率和死亡率高达100%。在2019年1月至9月期间，已经有26个国家/地区爆发猪瘟疫情。我国是世界最大的猪肉生产及消费国，生猪产业在我国人民生活和国民经济发展中具有不可替代的地位。2018年8月3日，非洲猪瘟传播进入我国，随后便很快地传播到全国大部分地区，我国已将其列为一类动物疫病。由于非洲猪瘟病毒基因类型多、免疫逃逸机制复杂，宿主免疫系统对此无能为力，且目前国内外至今仍没有有效疫苗或防疫手段。所以目前捕杀猪是控制疫情爆发的主要方法，在2018-2019年期间已经有超过3000万头生猪被捕杀。据估计，ASFV的大流行给全球养猪业造成了高达20亿美元的经济损失。2019年10月18日，国际顶级学术期刊《Science》（IF=41.037）在线发表了中科院生物物理研究所饶子和、王祥喜，及哈尔滨兽医研究所歩志高团队的论文Architecture of African Swine Fever Virus and implications for viralassembly，成功解析了非洲猪瘟病毒精细三维结构，让非洲猪瘟病毒在电子显微镜下首次现出原形，其关注度之高，以至于迅速窜上了新浪微博的热搜。饶子和院士还曾于2003年在国际上率先攻克SARS病毒中的关键蛋白结构，为我国成功控制SARS疫情做出了重要贡献。
该研究提供了非洲猪瘟病毒多种潜在的保护性抗原和关键抗原表位信息，阐述了结构蛋白复杂的排列方式和相互作用模式，并具体推测了非洲猪瘟病毒可能的组装机制，为揭示非洲猪瘟病毒入侵宿主细胞以及逃避和对抗宿主抗病毒免疫的机制提供了重要线索，从而为开发效果良好、安全性高的新型非洲猪瘟疫苗奠定了理论基础。非洲猪瘟病毒ASFV是Asfarviridae科的唯一成员，也是唯一已知的虫媒（节肢动物）DNA 病毒，ASFV在其宿主中的感染通常是无症状的，但会持续感染。ASFV靶向猪巨噬细胞（主要是存在于血液和骨髓中的单核细胞）。中国的研究团队首先从中国ASFV暴发猪场的猪脾样本中分离ASFV，从30-40日龄无病原体繁殖（SPF）的ASFV接种猪中分离出猪骨髓细胞株HLJ-2018，接着在PBM中培养，并从细胞上清液中纯化胞外ASFV病毒颗粒，然后用甲醛灭活病毒，并通过冷冻电子显微镜（EM，上海科技大学）检测纯化的病毒体（直径250-500 nm，43,811个粒子），通过二十面体法对ASFV进行了重建（分辨率为4-8埃）。
图1 中国研究团队解析出的ASFV病毒体架构。（A）二十面体ASFV病毒体结构的中心切片（左）和横截面（右）。外膜，衣壳，内膜，核壳和核苷分别以橙色、红色、深蓝色、青色和灰色上色。（B）ASFV衣壳和核壳的放射状着色表示。（C）ASFV衣壳的Cryo-EM重建图像，每种次要衣壳蛋白均以不同的颜色显示。（D）从衣壳内部观察的次要衣壳蛋白和衣壳蛋白的结构图解。（图片来源：Science）ASFV是具有二十面体形态且平均直径为200 nm的大型包膜病毒。尽管与其他大核质DNA病毒具有相似的结构、基因组和复制特性，但ASFV还拥有独特的多层结构和整体二十面体形态方面。高分辨率3D重建（高达4.1埃）清楚地显示了所有五层的结构。ASFV具有基因组核苷（第一层）、包被厚蛋白层（核心壳层，第二层），该蛋白层被内部脂质包膜（第三层）和二十面体蛋白衣壳（第四层）包裹，当细胞外ASFV穿过质膜出芽时，就会获得了外部包膜（第五层），其中最外层的包膜和最内层的核苷的密度较小。
图2 主要衣壳蛋白p72的结构和组织。（A）p72三聚体的密度图和原子模型。每个子单元以不同的颜色显示。右面板说明了侧链功能。带有侧链的残基被标记。（B）p72单体的带状图。（C）p72的表面外观。（D）三种不同的组装模式。（图片来源：Science）ASFV病毒颗粒包含3万余个蛋白亚基，组装成直径约为260纳米的球形颗粒。重建的核壳含有180个6桨状螺旋桨状旋覆层，带有一个中心通道（直径30埃）和12个五角星状体并被10个触角包围，构成了T=19的二十面体晶格。ASFV衣壳由2760个六聚体衣壳亚基和12个五聚体衣壳亚基构成，它们排列成T=277个二十面体晶格（h=7，k=12）。ASFV衣壳结构由17,280种蛋白质组成，包括一个主要衣壳蛋白（p72）衣壳蛋白和四个次级衣壳蛋白（M1249L、p17、p49和H240R）。
图3衣壳蛋白的广泛分子间网络维持衣壳稳定性。（A）衣壳蛋白络合物的Cryo-EM图。（B）次要衣壳蛋白p17的结构。（C）内衣壳处的分子间接触。（图片来源：Science）较小的衣壳蛋白在衣壳外壳下方形成复杂的网络，通过将相邻的衣壳蛋白维系在一起来稳定衣壳。M1249L核心组织蛋白（长100 nm）沿着连接两个相邻的对戊糖蛋白的每个边缘延伸，并与其他衣壳蛋白形成广泛的分子网络，从而推动了衣壳框架的形成。考虑到细胞内和细胞外ASFV均具有传染性，但其结构和抗原性不同，需要通过抗体组合同时靶向外膜蛋白和衣壳蛋白来阻断这两种感染型蛋白，以提供针对ASFV的有效防护。
图4 预测的ASFV衣壳装配途径。（A）在内膜上形成戊烯核。ASFV衣壳装配始于病毒内膜前体的出现，该内膜前体逐渐包裹核壳和核苷。在早期阶段，内膜通常呈现开放结构，具有各种内膜蛋白。戊烯复合物与内膜结合，然后募集p72衣壳形分子形成戊烯核心，从而启动组装。（B）由骨架蛋白M1249L，p17和p72衣壳异构体介导拉链结构的正确组装。（C）由十二个五叉形蛋白和三十个拉链蛋白构造多面体笼。（D）伴随多面体框架的形成，p72衣壳异构体填充三象子，从而完成了衣壳组装。（图片来源：Science）ASFV是目前已进行近原子分辨率结构解析的最大病毒颗粒，这些结构细节揭示了ASFV衣壳稳定性和组装的基础，为ASFV疫苗开发提供了新视角。ASFV病毒基因组由线性、封闭的双链DNA单分子组成。不同分离株的基因组长度在170至190 Kbp之间变化，编码151至167个开放阅读框。前人通过对编码主要衣壳蛋白p72的B646L基因C端区域的序列变异对ASFV进行了遗传表征，表明ASFV至少存在22种基因型，具有一定的遗传多样性。ASFV感染周期始于病毒吸附并进入宿主细胞。ASFV成功感染与猪巨噬细胞和单核细胞与CD163受体的表达相关，因为ASFV的感染需要巨噬细胞特异性受体，其他巨噬细胞表面蛋白可能也参与了感染过程。
图5 ASFV通过一个复杂的过程进入宿主细胞，该过程涉及动力蛋白和网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用。仅几秒钟后，ASFV就通过内吞到达内质网区室，并在此处发生病毒去壳和内病毒包膜与内质网膜融合。新合成的病毒体在病毒工厂中组装，并通过胞膜上的胞吐出芽或通过凋亡小体的形成而离开细胞。（图片来源：Viruses）在感染ASFV仅几秒钟后，ASFV就通过内吞途径进入细胞，并到达成熟的内质网区室。30到45分钟之内，病毒在成熟的内质网区室中的酸性管腔内去壳。一旦去壳，病毒颗粒就会暴露内包膜，从而使其相互作用，随后该病毒膜与内质网的限制膜融合，裸病毒核可以释放到细胞质中以开始复制。该过程高度依赖于内质网膜上的胆固醇，通过阻断胆固醇的运输会导致病毒体保留在内质网中，从而抑制感染进程。内包膜病毒蛋白pE248R也参与病毒融合。内质网成熟的其他抑制剂如诺考达唑（nocodazole，一种干扰微管依赖性内质网转运的抑制剂），也可以预防ASFV感染。入侵的ASFV病毒粒子可能到达靠近微管组织中心（MTOC）的核周区域中的复制位点。在DNA复制开始之前就立即表达早期基因。两条DNA链均可用作编码链。这可能是由于包装在病毒核心中的几种参与病毒转录的酶的作用。DNA复制后，中间基因和晚期基因开始转录。ASFV基因组大约20％用于编码参与其mRNA转录和修饰的基因。这种转录机制使ASFV与其宿主之间具有相对的独立性，并对其基因表达进行了精确的位置和时间控制。将病毒运输到发生复制的核周区域需要细胞微管，病毒结构蛋白p54在感染期间与微管动力蛋白相互作用，而干涉微管长丝聚合的诺考达唑能够减缓病毒工厂的形成。病毒工厂位于靠近细胞核质中，即MTOC的核周区域。在该位置病毒蛋白和DNA被积累起来，通过组装病毒二十面体衣壳和核心壳结构域而发展为二十面体中间体的前体。病毒体形态发生的最后一步是成熟病毒体的DNA衣壳化。最终新形成的病毒离开病毒工厂，通过驱动蛋白运输到细胞表面，并通过出芽释放出来，且胞外病毒被在出芽过程中获得的额外外部包膜。ASFV感染后会激活caspase并产生细胞凋亡反应。凋亡代表了一种重要的先天细胞机制，可以防止病毒感染，并且许多病毒已经开发出依次抑制或延迟这种细胞反应的策略。比如，ASFV 的A179L基因编码抗凋亡Bcl-2蛋白的同源物直到病毒基因组的复制完成，以延长宿主细胞的存活时间。该病毒Bcl-2在感染后的早期和晚期表达，并抑制几种促凋亡蛋白的作用。另一个ASFV基因，A224L，编码家族称为IAP蛋白的细胞凋亡抑制剂的成员，并且能够抑制蛋白酶活化，并促进细胞的存活。
图6 ASFV入侵细胞和脱壳模型。（图片来源：Vaccines (Basel)）1. NanWang, Dongming Zhao, Jialing Wang et al. Architecture of African swine fevervirus and implications for viral assembly. Science. Published 2019 Oct 17.doi:10.1126/science.aaz1439（https://science.sciencemag.org/content/early/2019/10/16/science.aaz1439.full）2. GalindoI, Alonso C. African Swine Fever Virus: A Review. Viruses. 2017;9(5):103.Published 2017 May 10. doi:10.3390/v9050103（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5454416/）
3. SánchezEG, Pérez-Núñez D, Revilla Y. Mechanisms of Entry and Endosomal Pathway ofAfrican Swine Fever Virus. Vaccines (Basel). 2017;5(4):42. Published 2017 Nov8. doi:10.3390/vaccines5040042 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5748609/）
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