一文读懂miRNA非经典与经典机制混合验证思路

众所周知，miRNA通过靶向结合mRNA，抑制其翻译或直接降解mRNA来调控靶基因的表达。我们通常认为miRNA是通过靶向结合mRNA的3’-UTR引起靶基因表达沉默来行使功能的，然而常常忘了miRNA除了靶向mRNA 3’-UTR，还可以靶向CDS或5’-UTR，而且靶向非3’-UTR和靶向 3’-UTR，对翻译的抑制机制是不同的。下面这篇文章的研究很有新意，研究发现两种miRNA以两种不同的方式结合靶基因，对靶基因行使不同的调控功能，我们一起来具体看下这篇发表在J. Pineal Res.（IF=15.22）上，名为“Melatonin-triggered post-transcriptional and post-translational modifications of ADAMTS1 coordinately retard tumorigenesis and metastasis of renal cell carcinoma”文章的研究内容。

1. 前言

肾细胞癌(RCC)约占肾癌病例的90%，患者易出现癌症转移，且预后差。ADAMTS1是一种基质金属蛋白酶（MMP），广泛参与肿瘤发展过程中的组织重塑事件，在不同的癌症类型中扮演着相互冲突的角色，其在RCC中的作用机制尚不明确。褪黑素由松果体分泌，对多种癌症具有抑制作用，然而其在RCC中的抑癌作用及其具体分子机制尚不清楚。

带着这些问题，研究人员进行了一系列研究，结果显示褪黑素触发的ADAMTS1转录后和翻译后修饰协同延缓RCC的发生和转移，下面我们来看下这篇文章研究思路和主要研究结果。

假说图

2. 研究思路

3. 方法与结果

1）RCC中ADAMTS1分析

对GEO中RCC相关数据集进行分析，结果显示ADAMTS1在癌组织中高表达，进一步研究发现ADAMTS1在转移RCC细胞中表达量高于原代RCC细胞（ADAMTS1虽然已经有众多的癌症研究报道，但其在不同癌症中的表达量及发挥的作用不同，因此首先要确定RCC中ADAMTS1的表达量）。TCGA-KIRC数据库分析显示ADAMTS1在RCC晚期患者中高表达，且预示不良预后。

细胞功能实验发现，ADAMTS1能促进细胞增殖，增强侵袭能力。（在确定表达量后，可以通过功能实验来初步验证ADAMTS1在RCC中的作用）

2）ADAMTS1与褪黑素作用分析

已有研究表明褪黑素通过调节不同MMP抑制不同疾病进展，同时研究人员前期蛋白组学结果表明ADAMTS1是褪黑素的潜在靶基因（前面有提到ADAMTS1是一种MMP，那么这里就很自然的能将褪黑素和ADAMTS1联系起来）。进一步研究发现mRCC细胞中ADAMTS1蛋白和mRNA水平随褪黑素浓度的升高而降低。细胞功能实验表明ADAMTS1能显著逆转褪黑素对mRCC细胞集落形成和侵袭的抑制作用（要将褪黑素和ADAMTS1联系起来分析，表达量变化和功能实验依然是少不了的）。

动物实验结果表明敲减ADAMTS1和褪黑素处理后均能抑制肿瘤生长，降低肿瘤转移程度，而过表达ADAMTS1能显著逆转褪黑素对癌转移的抑制作用，表现出更强的浸润性（上面进行了体外细胞功能实验，初步确定了ADAMTS1与褪黑素的作用关系，体内实验则能进一步验证这一关系，说服力更强）。

褪黑素的经典作用机制是通过两个受体参与调节下游效应，进一步研究发现褪黑素调节的ADAMTS1表达并不受其受体影响（提示存在其他的调控机制）。

3）褪黑素对ADAMTS1的调节机制 

前面有提到褪黑素抑制ADAMTS1 mRNA的表达，具体机制如何？研究人员利用miRNA靶基因预测软件结合miRNA芯片，确定 miR-let-7f。过表达miR-let-7f，两类mRCC细胞中ADAMTS1蛋白水平均显著降低，mRNA水平不变，细胞侵袭能力减弱（这里研究人员发现了一种较少研究的miRNA调控模式，miRNA影响蛋白水平，但不影响mRNA水平，这一点可谓是文章的一大亮点和创新点）。

为确定miR-let-7f是否通过靶向ADAMTS1 3’-UTR来抑制其表达，将包含推测的miR-let-7f结合位点的ADAMTS1 PCR产物插入荧光素酶报告载体，与miR-let-7f mimic或褪黑素联合转染至mRCC细胞。结果显示，褪黑素处理能降低了荧光素酶的活性而单纯miR-let-7f mimic就做不到这一点（这一点表明miR-let-7f并不与ADAMTS1 3’-UTR结合）。为进一步确定miR-let-7f是否可以直接靶向ADAMTS1基因，作者使用了Ago2 RIP实验进行验证，结果显示miR-let-7f可以直接结合到ADAMTS1基因上（miR-let-7f不与ADAMTS1 3’-UTR结合，那是否存在其他的结合方式，RIP实验来确定结合关系，结合位点在非3’-UTR区）。同时临床分析发现miR-let-7f高表达预示良好预后。

已有文献报道miR-181d能调控ADAMTS1的表达，进一步研究发现过表达miR-181d显著抑制mRCC细胞中ADAMTS1 mRNA和蛋白水平，而miR-181d inhibitor能部分逆转抑制作用。荧光素酶报告实验结果显示miR-181d mimic和褪黑激素处理均能显著降低ADAMTS1 3ʹUTR荧光素酶活性（提示miR-181d对ADAMTS1的调控是常规的mRNA水平调控，结合位点在3’-UTR）。细胞功能实验表明过表达miR-181d，能显著下调细胞的侵袭能力。临床分析发现miR-181d高表达预示良好预后。

最后研究人员分析了褪黑素引起ADAMTS1蛋白水平下调的机制，结果发现褪黑素是在翻译后通过诱导蛋白酶体依赖的蛋白泛素化来降低ADAMTS1蛋白的稳定性。

4. 总结 

两种miRNA调控同一靶基因的研究不多见，两种miRNA以不同的方式与靶基因结合，行使不同调控功能的研究更是少见，所以这篇文章创新性还是很不错的。近几年以lncRNA和circRNA为主的非编码RNA研究可谓进行的如火如荼，然而miRNA研究一直保有热度，值得科研投资，毕竟它是非编码RNA的“老大哥”嘛。

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