一石双鸟：一个环状RNA circ-Foxo3，两篇paper（上）

环状RNA是新的研究热点之一，一石双鸟：一个环状RNA circ-Foxo3，两篇paper（上）和（下），将分别介绍一个新环状RNA分子circ-Foxo3的两篇文章：

1. Foxo3circular RNA retards cell cycleprogression via forming ternary complexes withp21 and CDK2. Nucleic Acids Res（IF 9.1）. 2016 Feb 9.

2. Foxo3 circular RNA promotescardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress andsenescence responses. Eur Heart J（IF 15.2）. 2016 Feb 11。

题目：Foxo3 circular RNA retards cellcycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2

杂志：Nucleic Acids Research （IF 9.1）

时间：9/2/2016

研究团队：本文的通讯作者Burton B.Yang主要的研究胞外基质及蛋白多糖的作用。环状RNA是新的研究热点，作者在今年二月份同时发表了两篇circ-Foxo3的文章。本文提供了circRNA与蛋白结合发挥调控作用一个新的思路。接下来，我们会分享另一篇文章，看看临床与基础相结合的设计方式。

背景：

p21是周期素依赖激酶（CDKs）抑制剂，通过抑制CDKs复合物活性，来调控细胞周期进程。环状RNA包括，存在于胞浆中含有外显子的circRNA，以及存在于胞核内含有内含子的ciRNA。而circRNA则充当miRNA抑制剂，起到miRNA海绵的作用。因为miRNA在调控蛋白表达、细胞生理学上都起着很重要的作用，那么circRNA在细胞增殖、分化应该也会起着重要的调控作用。

关于环状RNA发挥microRNA“Sponge”作用的介绍，可参考第一季文章“聊基金系列•第四期: 环状RNA （猜谜：一刀切完，只剩一段）”

作者发现了一个环状RNA：circ-Foxo3（由Foxo3基因编码），它在非癌细胞中高表达，并与细胞周期进程相关。沉默掉circ-Foxo3之后，细胞增殖速度变快；高表达的circ-Foxo3能通过结合CDK2、p21来抑制细胞周期进程。CDK2与周期蛋白A、E结合来促使细胞周期正常推进，而p21则抑制这种作用关系来阻滞细胞周期进程。

主要内容：

1、首先验证了circ-Foxo3的表达能抑制细胞周期进程；

• 实验表明，在非癌细胞和肿瘤细胞中circ-Foxo3和Foxo3水平成相反关系，而Foxo3能调控蛋白表达、细胞增殖和分化；所以circ-Foxo3与细胞周期进程、增殖应该也相关；

• 接下来的细胞实验，作者发现细胞汇合度越高，细胞周期受阻，处于G1期的细胞分布越高，其circ-Foxo3的表达越高；

• 用EGF（表皮生长因子，一种细胞增殖因子）处理后，circ-Foxo3的水平降低。反之，用EGF抑制剂处理后，细胞中的circ-Foxo3的水平增高。

*汇合度不仅仅是细胞的密度或铺满度，它也能够反映细胞的生长状态。如果汇合度过高，由于空间、营养物质的限制，细胞的生长分裂都会受到抑制。

• 沉默circ-Foxo3后细胞增殖对应于对照组或野生型细胞增加了，这表明：内源性circ-Foxo3对细胞增殖能起到调控作用。

• circ-Foxo3转染细胞处于G1期的circ-Foxo3细胞分布要高于对照组，而S、G2期则该细胞分布要少很多。

• 用多个细胞系验证，发现转染了circ-Foxo3的细胞生长要慢很多，绝大部分细胞都处于G1期。

• 所以，上述实验表明circ-Foxo3能抑制细胞周期进程。

2、前期报道，CDK2通过结合周期蛋白来推进细胞周期进程，而p21则可以抑制这种作用关系，来抑制细胞周期进程。所以，作者想了解circ-Foxo3是如何起作用来影响细胞周期进程的。

• 分别用circ-Foxo3以及线性Foxo3探针，去结合一些细胞周期相关蛋白，然后分别用这些蛋白的抗体去沉淀circ-Foxo3、Foxo3。作者发现CDK2和p21抗体下拉circ-Foxo3特别明显，而线性Foxo3则未被拉下。转染circ-Foxo3的细胞，CDK2、p21抗体能拉下更多的circ-Foxo3。

• 后期细胞实验发现，能被CDK2、p21抗体大量沉淀下来circ-Foxo3的细胞主要处于G1期。这也可以验证了第一部分的结果：circ-Foxo3能在G1期阻止细胞周期进程。

• 这表明CDK2、p21与其他的实验对象有很大的不同，这有可能是CDK2、p21在circ-Foxo3介导细胞周期进程中起着很重要的作用。

3、验证circ-Foxo3通过与CDK2、p21形成三聚体来抑制细胞周期进程。

• 作者用CDK2、p21并不能拉下其他的一些circRNA，这说明circ-Foxo3与CDK2、p21的是一种特异性的结合关系。

• CDK2本身能够与周期蛋白A、E结合，p21能阻止它们的结合作用。在circ-Foxo3转染实验发现，用CDK2抗体去沉淀周期蛋白A、E时，沉淀下来的量很少。而分别用周期蛋白A、E的抗体去沉淀CDK2，同样发现沉淀下来的CDK2很少。这表明，存在circ-Foxo3的同时，p21能增强抑制CDK2结合周期蛋白。

• 之前实验已经发现，circ-Foxo3主要存在于细胞的G1期中。作者猜测由circ-Foxo3介导的CDK2、p21作用是否就发生在G1期。经研究发现，只有在G1期中，CDK2抗体能沉淀大量的p21，p21也只有在G1期中能沉淀大量的CDK2。

• 这就可以表明了，circ-Foxo3、CDK2、p21是形成了一个三聚体来发挥作用。作者用梯度凝胶电泳实验，验证了他们的结合关系。

4、对上述的三元复合物是抑制细胞周期进程原因进行反向验证，确定阻止三元复合物的形成是否能推进细胞周期进程。

• 沉默掉circ-Foxo3后，相对于对照组，p21抗体拉不到CDK2，同样CDK2抗体也拉不到p21。而周期蛋白A、E抗体能够沉淀更多的CDK2。说明，在circ-Foxo3缺失的情况下，CDK2恢复了与周期蛋白A、E结合作用。免疫印迹实验也表明，在该实验组情况下，形成的p21-CDK2复合物不明显。

• 沉默掉p21后，相对于对照组，p21抗体沉淀circ-Foxo3减少了。而circ-Foxo3的总水平并未改变。这说明p21与circ-Foxo3作用，p21量少了，拉下来的circ-Foxo3也少了。沉默掉CDK2后，同样并不影响circ-Foxo3表达量。相对于对照组，用CDK2抗体沉淀的circ-Foxo3水平降低了（同理），并且CDK2沉淀下来的p21、CDK2量都减少了。而用p21抗体沉淀，只有CDK2的沉淀水平降低，circ-Foxo3水平保持不变。这说明circ-Foxo3、 p21、CDK2形成了一个三聚体，介导p21、CDK2作用。

5、确定circ-Foxo3和CDK2、p21的结合作用。

• 作者使用酵母双杂实验，在circ-Foxo3转染细胞组实验中，可以用circ-Foxo3探针将CDK2、p21都沉淀下来。同样证明它们之间的作用关系。

• 沉默了circ-Foxo3后，拉下来的circ-Foxo3蛋白明显减少。并且被拉下来的p21、CDK2蛋白水平也更低。

• p21沉默细胞中，circ-Foxo3探针只能沉淀很少的p21，但CDK2沉淀水平没有变。而恢复p21水平，对circ-Foxo3-CDK2作用不起变化，所以除了三聚体外还存在一个circ-Foxo3-CDK2复合物。而沉默掉CDK2，circ-Foxo3探针沉淀CDK2水平降低，而沉淀p21水平不变。

6、p21、CDK2的结合位点的保护机制验证

• RNAse A能够降解蛋白中的RNA。作者通过用不同浓度的RNAse A处理circ-Foxo3转染细胞，发现在低浓度时出现两条带。而高浓度的RNAse A能够彻底破坏三元复合体。

• 过表达circ-Foxo3细胞，无论是否加入RNAse A孵育，p21、CDK2抗体都能拉下高水平的p21和CDK2。如果转入的是空质粒，则p21抗体拉不到CDK2，CDK2抗体也拉不到p21。说明了，circ-Foxo3与p21、CDK2结合作用，阻止了RNAseA结合circ-Foxo3的位点使得circ-Foxo3降解。

• 用不同汇合度的细胞去验证，发现在汇合度高的时候，用低浓度RNAse A处理的转染细胞出现两个条带。说明了，该作用发生在细胞生长受阻或停滞的情况下。

全文下载，百度云盘：http://pan.baidu.com/s/1hr9qXnA

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