生物学家被化学试剂坑的血泪史|《自然》技术专栏

原文以Reproducibility: Check your chemistry为标题

发布在2017年8月23日的《自然》技术版块上

原文作者：Monya Baker

化学探针和筛选库很容易被弄混弄错，给粗心的生物学家带来错误的结果。

Stefan Knapp得到的结果让他感觉自己像是在坐过山车。Knapp是德国法兰克福大学的药物学家，他和同事鉴定出了一种对肿瘤生长非常重要的蛋白，还发现了一种能够抑制这种蛋白的类药分子。为了进行进一步的实验，他们购买了更多的这种化合物，但是却失效了。他们随后从另一家供应商购买了同样的化合物，得到的结果却是比最开始那组实验更为有效。

上图所示为位于瑞士巴塞尔的诺华制药公司的化学药品库，里面容纳了大约300万种分子。

Novartis AG

原来，这个问题当中的分子存在对映异构体形式，化学结构互为镜像但仍然不同，就像右手和左手的手套。Knapp推断供应商出售的是两种异构体不同比例的混合物，而只有左旋体在课题组的试验中是有效的。（意想不到的是，右旋体是肺癌药物克里唑蒂尼的活性形式，通过另一种不同的机制发挥作用。）

维也纳分子药物研究中心的系统生物学家和工作负责人Guilio Superti-Furga表示，该课题组的研究工作仅仅揭示了化学试剂妨碍生物实验的众多形式中的一种。有时候，科学家不知道他们拿到的是什么化学物质。另外一些时候，分子的作用没有实验者想象的那么有效。Superti-Furga说，这两个问题的同时存在，降低了使用化学方法去探究生物学的潜力。

加州斯克里普斯研究所的免疫学家和化学家Kim Janda则更加直白地表示：“如果你不注意化学，它就会反咬你一口，给你带来大麻烦。”

经验教训

研究人员在细胞生物学的方方面面都依赖化学试剂。它可以用作解析蛋白功能的工具化合物或化学探针。例如，与通过基因技术完全阻止酶生成相比，使用小分子来抑制特定酶，能够为研究蛋白质的生物学特性提供更加细致的线索。化合物有时也会被堆积在化学药品库中，在库里全体一起被筛选，希望能从中找到有用的试剂和药物。

在这两种情况下，混合、杂质和种种预想不到的状况都可能让不明真相的科学家徒劳无功。多年来，科学家们已经对试验中化学相关的假象发出了警报，但对这些问题的认识尚不广泛。一些在线资源能够提供帮助。由专家组织建立的化学探针门户网站（www.chemicalprobes.org）评估了100多种单独的工具化合物。探针矿工网（http://probeminer.icr.ac.uk/）和探针与药物门户网站（www.probes-drugs.org）汇总了公开可用的信息，帮助研究人员选择使用哪种化学品。

事实上，评估研究人员购买到的化学品的质量并不容易。试剂通常含有合成副产物或试剂降解时所形成的杂质。化学家Josh Bittker领导着博德研究所的一个高通量筛选课题组，他们收集了一个已经在临床试验中测试过的化合物库，借此机会了解到了污染是多么的普遍。

令他吃惊的是，在该团队测试的8584个分子中，有接近29%没有通过质量控制检测，即杂质含量达15%以上。通常，来自同一供应商的另一制造批次的样品可以通过测试，特别是当样品是以干粉而不是溶液的形式提供时，溶液形式便于实验但易于降解。

实际问题可能更严重。Bittker的筛查是通过分子量来评估化合物，所以并没有检测样品是否包含多种异构体，即化学式相同但原子排列不同的分子。

丰富的化学品

药物化学家喜欢说，药物尺寸的分子可能存在的结构比宇宙中的星星还多。商业供应商销售的化合物可能超过一千万种。研究者如果要寻找特定分子，可能需要找到专门的供应商，从其他相关研究者处获取，或者合成好化合物去订购。

然而，如果一种分子的生物活性已在一篇备受瞩目的论文中报道过，特别是如果已经在临床试验中测试过，那么该分子则可能被十几个甚至更多的供应商销售。制药公司有时会授权供应商去生产或分销其药物的试剂级版本；这样所得的试剂更可靠，但价格也更高。

在一个臭名昭著的案例中，近20家供应商提供一种已获批的抗癌药物博舒替尼，却被发现实际出售的是一种化学基团错乱的相关结构（参见下图“发现不同”和网页go.nature.com/2w3dz0a）。博舒替尼和另外那一种结构都结合了一组细胞信号传导蛋白，但其功效不同，这种混淆可能会使数十篇论文遭到质疑。

Source: Chem. Eng. News90(21), 34–35 (2012)

Dimitrios Tzalis是德国多特蒙德的合同研究机构Taros的首席执行官，他建议从值得信赖的供应商处购买试剂，而不是为了省钱而选择未经检验的渠道。他说：“廉价的代价可能是非常昂贵的。”

Bittker同意这种观点，他说当你购买试剂时，“你必须知道你在做什么，你要找的是什么。如果一个交易划算得不像真的，那么它可能就不是真的。”如果供应商不愿意讨论或提供质量控制数据，应该引起注意。很多供应商从第三方购买化合物，再转售给科学家，这会使质量存疑。他说：“如果没有信息链能够追溯到从实验上确认样品的人，那就不值得信任了。”

有时候文献也有错误。英国牛津大学的化学生物学家Kilian Huber读到一篇报告说一种名为SCR7的酶抑制剂可以提高CRISPR-Cas9基因编辑技术的效率，于是决定在自己的实验室里尝试一下。结果，他的研究生无法合成相应结构的化合物，他最终放弃了该项目。

这种情况体现了使用化学工具的主要不确定性：英国布里斯托尔的化学试剂公司Tocris后来报道称，多个SCR7的供应商实际上销售的是与该分子相关、但并不一样的结构（参见go.nature.com/2vapstf），并提出最初报道的分子结构是无效的。另外，其他研究人员质疑这些分子是否是通过抑制所描述的特定酶而产生作用的。

该抑制剂最早的发现者告诉《自然》，在他2012年的那篇论文里面，确实是正确的酶得到抑制，但是文中描述的SCR7的结构是不稳定的。SCR7会转变为一种环状结构，而该论文或Tocris公司都没有提到。

Janda也遇到过同样的情况。有文献称有一种分子能够提高肿瘤抑制蛋白的表达，于是他决定做一些后续研究，结果发现该分子是不活跃的。一开始，Janda怀疑是他博士后的有机合成技能有问题，后来他意识到，那些研究并没有自己合成化合物，而是使用了分销商提供的试剂，包括美国国家癌症研究所。

这些分销商提供了错误的分子，导致原始出版物的内容发生了错误。事实情况是，一家利用该化合物进行临床试验的公司在原始的知识产权文件中记录了错误的结构。该专利最终被重新发布，但是那已是在Janda提交正确结构的专利申请而引起哗然之后了。

Janda说，我们无法知道这类错误是多么常见，但是显然大部分都没有被发现和报道出来。

在Nick Levinson看来，怀疑的态度非常关键。他在做博士后的时候花了几个月的时间，试图弄清楚博舒替尼如何结合蛋白靶点，最后他的结论是，他使用的根本就不是博舒替尼，而且很多其他的研究者也一样。

Levinson说：“我在实验室里做的和别人最不一样的事就是，我对结果保持较高的怀疑态度。如果我们得到了看起来是错误的或者是出人意料的结果，我头脑中想到的第一件事情就是，使用的化合物可能是错的。”他现在是明尼苏达大学的药物化学家，他说发现问题并不总是容易的。

在发现博舒替尼问题的过程中，用到了相对专业的核磁共振（NMR）光谱仪，另外，一个已公开出来的结合该异构体的蛋白晶体结构也起了大作用。但是科研人员经常不进行任何鉴定就直接使用试剂。

不纯的产品

伦敦癌症研究所所长Paul Workman建议，无论何时，科研人员在使用新的化学探针时，都应该至少使用两种鉴定方法来对其进行核实，或者找能够核实的同事帮忙。他说：“我们正在尝试教育生物学界更加尊重对化学知识的需求。”

一位优秀的生物学家永远不会不先进行对照组实验就使用一种抗体，或者不先进行测序就使用同事的克隆基因。在使用化学探针时也应该同样小心，应该先通过质谱分析法、NMR或其他方法进行测试（参见“使用化学品的六个注意事项” ）。

使用化学品的六个注意事项

美国国家癌症研究所化学合成和药品资源库的主任Joel Morris说，科研团队要花多少功夫去鉴定化合物及其纯度取决于具体实验。如果某化合物只是筛选库的一个组成部分，那么在它们显示出生物活性前，可能不值得去进行大量的工作；而对于在细胞或动物研究中有突出表现的单一化合物，应该事先进行仔细检查。他和其他人提供了一些建议，以帮助使发生错误的风险最小化。

• 使用化合物的CAS编码（一种与化合物结构对应的唯一编码）来下订单，而不是化合物的名称。

• 索取一份详细说明外部供应化合物接受的质量控制分析的证明，包括高效液相色谱、质谱和核磁共振谱等数据。

• 询问外部来源的化合物是如何制备的。这能够帮助决定需要考虑哪种杂质。

• 对收到的化学品进行独立分析。

• 如果一个化合物存在多种结构形式，则通过测量光学纯度或使用手性色谱法来确定所得的是哪种结构形式。

•要绝对确保化合物的结构完整性和纯度，则在机构内部合成。

即使提供的化学品所含化合物是正确的，用它得到的结果仍有可能是错误的。新泽西州纳特利罗氏公司的科学家Johannes Hermann领导了一项新药研发工作，发现了一系列看起来能够抑制一种刺激酶的分子。正如预期的那样，这些分子浓度越高，抑制作用越明显，这表明这些结果不是伪现象。

之后，药物化学方面的研究结果变得不合理了：对分子结构的微小调整可能显著改变其活性，而较大的调整却没有作用。最后，Hermann和同事意识到，显示出活性的化合物有一些共同点：它们是在有锌的情况下合成的。当研究人员将锌单独添加到试验当中时，得到了和之前一样的结果。

为了确认这件事，他们将金属结合分子（即螯合剂）与化合物一起加入进去，结果发现没有活性。目前在新泽西州拉里坦强生公司担任数据科学家的Hermann说那是一次痛苦的经历。他建议在探明螯合剂是否会改变结果之前，不要投入时间或资源去跟进偶然的一次“命中”。

Hermann的经历在工业界是不常见的，因为他可以花时间记录下来。其他的药物化学家描述了自己遭遇到的类似挫折，但引起问题的是铜和钯。合成中使用的小的无机化合物，如联氨，也能通过抑制目标酶或改变其活性评估结果而破坏实验。

试剂的问题往往是从试剂瓶被打开之后开始的。德国默克集团的生命科学试剂部门负责人Heather Holement说，反复的冷冻和解冻会使化合物性能下降，还有一些化学物质并不能在冷冻时保持稳定。

当溶解在有机溶液中的化学物质被加入到水基环境中时，例如在细胞和蛋白分析中，它们有时也会从溶液中析出。她建议科研人员应该考虑到储存的试剂的质量，而且永远不要忘记单独使用溶剂进行对照组实验。还可以通过不使用细胞或蛋白进行的分析来排除一些错误的信号。

有时，一种化合物的明显活性实际上归因于携带它的“交通工具”。澳大利亚莫纳什大学的血液学专家Jake Shortt使用一个常用的实验方法，将抗癌化合物溶解在一种被称为NMP（N-甲基-2-吡咯烷酮）的溶剂中，然后将其注入小鼠体内，令他吃惊的是，即使是在对照组，即只被注射溶剂而无被测试化合物的组中，仍然能看到肿瘤产生响应。

这些数据表明，NMP本身具有抗癌活性，Shortt现在开始在临床上进行NMP测试。但他表示，其他人仍在将NMP作为一种所谓的惰性液体来溶解药物化合物。

对于Bittker所做的这种筛选实验而言，最受关注的时候是首次发现“命中”的时候。化学药品库里的药物保存数月甚至数年时间都很常见，导致它们容易降解和被弄混。他说，验证结果的第一步是使用相同的材料再进行一遍筛选实验，筛选分析可能充满了噪声信号。

下一步，研究人员应该尝试不同来源的相同化合物，理想的情况是在机构内合成或通过合作者合成。如果结果显示命中的并不是预期的分子，Bittker建议就不要尝试去确定活性组分。他说：“那就是一个兔子洞。如果有杂质，就随它去吧。”

对于正在筛选天然产物的研究人员来说，可能需要换个方式看待这种建议。芝加哥伊利诺伊大学天然产物专家Guido Pauli说，植物提取物和类似来源的物质几乎总是混合物，而不是纯试剂。在很多情况下，提取物越纯，其活性越低，这意味着一些被认为是最常见的成分造成的效果，实际上是由其他成分造成的。

即使天然产物得到相对充分的表征，混合物也是一个问题。以庆大霉素为例，它是一种在工业上通过从生长在发酵罐内的细菌中分离出来的抗生素。斯坦福大学的药物化学顾问Robert Greenhouse表示，细菌会产生几种紧密相关的具有不同活性和毒性的分子，但商业制剂含有的这几种分子及含水量比例不一样。因此，不够细心的研究人员不会知道他们在实验中使用的抗生素的确切的量或确切形式。

即使一个分子被正确鉴定出来，它也可能不是通过以特定方式真正地与特定蛋白结合而发挥作用的。例如，在一个类皂涂层中，“聚合体”覆盖了其他分子。这些假象通常可以通过向试验中加入净化剂而被揭示出来。

Workman说：“有时候你的化合物是对的，只不过被污染了。”

他说资源和教育非常关键，但是责任还是落在科学家自己身上。正确以及恰当地使用小分子化合物是每个科研工作者的责任。当需要使用化学试剂的时候，请记住一句比任何硬性规则都重要的“至理名言”：购者自慎—货物出门概不退换。ⓝ

Nature|doi:10.1038/548485a

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